小鼠窦卵泡卵母细胞分离：从新鲜获取的小鼠卵巢中分离窦卵泡卵母细胞的方法

摘要

来源：Monti, M. 等. 基于核仁染色质结构的小鼠窦卵泡卵母细胞的分离与鉴定. J. Vis. Exp. (2016)

本视频介绍了从新获取的小鼠卵巢中分离窦状卵泡卵母细胞的方法。这些窦状卵泡卵母细胞可用于进一步的表征和发育研究。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 动物

1. 将3至6周龄的成年雌性小鼠饲养于温度和湿度受控的环境中（12小时光照：12小时黑暗循环），并提供饲料 随意摄取).
2. 腹腔注射2.5 IU孕马血清促性腺激素（PMSG）以模拟卵泡刺激素（FSH）的作用，促进小鼠卵泡发育。48小时后摘除卵巢，收集窦状卵泡中的卵母细胞。根据标准操作指南，处死此前已注射PMSG的雌性小鼠。
3. 迅速将卵巢从体腔中取出，并放入含有M2培养基的培养皿中，用于后续卵母细胞的分离（参见 第3节).
   1. 用无菌解剖剪在覆盖腹壁的皮肤上做一切口，随后切开腹膜。撑开切口以暴露腹腔，用无菌镊子将肠管移向一侧，找到呈V形走向、自膀胱起始的子宫输卵管。
   2. 观察位于肾脏下方的卵巢。用无菌镊子夹住每根输卵管，并在卵巢底部做一小切口以释放卵巢。将两侧卵巢转移至含有预平衡培养基的培养皿底部。

2. 激素制备

1. 用无菌等渗生理盐水稀释PMSG（可提供不同储存浓度），配制工作浓度为每0.1 mL含2.5 I.U.激素，以适应适当的注射体积。
   注意：激素溶液必须分装至0.5 mL离心管中，于-20 °C保存至使用当日。稀释后的分装样品在-20 °C下保存不得超过三个月。一旦解冻，若需进行连续注射，应将激素溶液分装样品置于+4 °C保存，并在4天内使用完毕。

3. 窦卵泡卵母细胞的分离

为了正确分离卵母细胞：

1. 在开始卵母细胞分离操作前，将M2培养基（M2）置于5% CO₂和37 °C条件下平衡至少1小时。准备两个培养皿（35 mm × 10 mm），其中一个加入1 mL M2用于卵巢穿刺，另一个则加入少量M2液滴（每滴20 µL），并用矿物油（约1.5 mL）覆盖，用于从卵巢中分离后的卵母细胞转移（见步骤3.4–3.6）。将两个培养皿均置于5% CO₂和37 °C的培养箱中，待用时取出。
2. 卵母细胞分离操作过程中使用体视显微镜。
3. 通过将玻璃巴斯德吸管水平持握（双手各持吸管一端），并在本生灯垂直火焰上加热拉伸，制备细口玻璃吸管，用于收集卵母细胞（图1）。
   1. 当玻璃开始熔化时，将吸管从火焰中取出，并迅速进行拉伸操作，以获得所需吸管。用指甲紧靠吸管狭窄处切断多余玻璃部分，以调节吸管长度和毛细管内径。确保细长毛细管的内径约为100 µm，略大于卵母细胞直径（约80 µm）。
   2. 进行口吸操作时，使用合适的接头将吸液管一端连接至拉制好的玻璃吸管，另一端放入口中，并用牙齿固定。
4. 使用无菌镊子取出卵巢，并将其放置于细胞培养用培养皿（35 mm × 10 mm）底部。加入1 mL预先在37 °C和5% CO₂条件下平衡的M2培养基覆盖（图2）。
5. 用无菌胰岛素注射针头轻轻穿刺卵巢中的窦状卵泡，使窦状卵母细胞释放至M2培养基中（图3）。
6. 用细口巴斯德吸管轻柔地口吸卵母细胞，以去除卵丘细胞及其他可能的组织碎片（图4A），随后将其转移至预先准备的、覆盖有适用于胚胎培养的矿物油的小滴M2（每滴20 µL）底部（图4B）。
   注意：需通过在多个不同的M2液滴中反复吹打，彻底去除附着于卵母细胞透明带上的所有卵丘细胞。此步骤应尽快完成，以避免培养基pH值发生改变。

结果

图1. 使用玻璃巴斯德吸管和本生灯制备口腔吸管。

图 2. 置于盛有预热并平衡过的 M2 培养基的培养皿中...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PMSG	Sigma	G4527
EmbrioMax M2	Millipore	MR-015-PD
矿物油	Sigma	M8410
细胞培养皿 35 mm × 10 mm	Corning	430165
µ-Dish 35 mm，高玻璃底	Ibidi	81158
巴斯德吸管（硼硅酸盐）	Corning	7095D-9
校准毛细移液管用抽吸管组件	Sigma	A5177