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方法文章

胆道系统树脂铸型:利用不透射线树脂注射分析小鼠模型胆道系统三维结构的技术 关键词:胆道系统,树脂铸型,三维结构,小鼠模型,不透射线树脂,放射成像

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2025年7月8日

本文内容

摘要

来源:Hankeova, S. . DUCT:双重树脂铸型结合显微计算机断层扫描用于肝脏三维分析. J. Vis. Exp. (2021)

本视频介绍了胆道系统树脂铸型的操作流程,以帮助理解胆道系统的三维结构。该技术可提供胆道系统内径大小及网络连接情况的信息,可用于肝脏再生分析。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会的审核

1. 双重树脂注射

  1. 准备
    1. 准备树脂溶液。对于双系统树脂注射,按照步骤 1.1.2–1.1.4 所述方法分别准备黄色和绿色树脂。
    2. 每只小鼠准备 1 mL 稀释后的树脂分装液。
    3. 黄色树脂:将黄色硅橡胶(高放射不透性)与透明稀释剂按 3:1 比例稀释,以制备用于注射的黄色树脂。
    4. 绿色树脂:将蓝色硅橡胶(无可检测的放射不透性)与透明稀释剂按 1:1 比例混合,制备蓝色树脂。为生成绿色树脂,将稀释后的蓝色树脂与稀释后的黄色树脂按 1:1 比例混合。充分涡旋震荡绿色树脂,直至颜色均匀。
      注意: 蓝色树脂的放射不透性极低,在微计算机断层扫描(microCT)中无法检测,因此必须与黄色树脂混合,以制备出具有不同放射不透性的两种树脂。
      警告: 树脂可能含有铬酸铅,属于致癌物,在火灾中会产生有毒气体。请小心操作,并将树脂作为危险废物处理。
    5. 按照步骤 1.1.6–1.1.11 所述方法,准备两套注射装置(注射装置 #1 和注射装置 #2),并连接导管。
      注意: 对于成年小鼠(>P30(出生后第 30 天)= P30 至 2 年龄),使用注射装置 #1(外径 0.6 mm 的 PE10 导管)进行胆总管注射,使用注射装置 #2(外径 0.96 mm 的 PE50 导管)进行门静脉注射。对于幼年出生后小鼠(不超过 P30),准备两套 #1 注射装置,分别用于胆管和门静脉注射(无需使用注射装置 #2,因为门静脉过窄,无法容纳 PE50 导管)。
    6. 制备注射装置 #1:剪取 30 cm 长的 PE10 导管,用手拉伸导管一端,使其尽可能变细(图 1A、B,拉伸后直径约 0.15 mm,未拉伸的 PE10 导管直径为 0.6 mm)。
    7. 将拉伸后的 PE10 导管末端斜向剪切,形成斜面尖端(图 1B)。
    8. 将 PE10 导管未拉伸的一端连接至 30 G 针头(图 1A,注射装置 #1)。
    9. 制备注射装置 #2:剪取 30 cm 长的 PE50 导管,用手拉伸导管一端,使其足够细,以便插入门静脉(图 1A、B,拉伸后直径约 0.7 mm,未拉伸的 PE50 导管直径为 0.96 mm)。
    10. 将拉伸后的 PE50 导管末端斜向剪切,形成斜面尖端(图 1B)。
    11. 将 PE50 导管未拉伸的一端连接至 23 G 针头(图 1A,注射装置 #2)。
      注意: 每套注射装置仅可用于一次注射,因为树脂会在注射器和导管内固化。根据小鼠年龄、基因型和表型对应的胆总管和门静脉大小,调整拉伸和斜面尖端的尺寸。若不确定导管尺寸是否合适,可在切开后、向导管填充树脂前,先将导管插入相应导管或血管中测试。若导管过宽无法插入,应进一步拉伸。
    12. 通过吸入异氟烷麻醉动物(诱导室中初始浓度为 4%,随后通过鼻罩维持约 2%)。
    13. 将小鼠置于解剖垫上的通风操作台上,使其通过鼻罩吸入异氟烷。采用机构或机构审查委员会(IRB)推荐的方法确认动物已失去意识,例如轻捏一只脚掌。
      警告: 吸入异氟烷可能导致嗜睡或头晕,长期或反复暴露可能对心血管系统和中枢神经系统造成损害。切勿吸入。应在通风操作台及通风良好的区域操作该物质。
      注意: 可使用其他麻醉方法,只要其与心脏灌注兼容即可。
    14. 动物失去意识后,用 70% 乙醇喷洒腹部表面,以防止毛发干扰。
    15. 使用皮肤剪刀从腹腔正中线开始,切开皮肤、筋膜和肌肉层,直至胸腔,以暴露内脏器官。
    16. 用镊子夹住剑突,抬起胸骨,并在两侧剪开膈肌和肋骨,以暴露心脏和肺。
    17. 用剪刀剪断左右两侧肋骨,移除肋骨笼。操作时需格外小心,避免损伤肝脏,否则会导致树脂泄漏。
    18. 用直头镊子将心脏向肝脏方向牵拉,并剪除右心房。
    19. 将连接至蠕动灌注泵的蝴蝶针(23 G)插入左心室。通过汉克斯平衡盐溶液(HBSS)和肝素(1 U/g 小鼠体重)进行心脏灌注,灌注速率为 5 mL/min,持续 3 分钟。
      注意: 若灌注正确,内脏器官将变得苍白,尤其是肝脏。若肺部变白,则说明针头插入了右心室,需重新调整位置。灌注完成后,小鼠已放血,可将其从鼻罩和异氟烷中移出。
    20. 关闭异氟烷泵。

2. 树脂灌注——胆道系统树脂铸型

  1. 将小鼠移至解剖显微镜下,腹部朝上,尾部朝向操作者,头部远离操作者。感兴趣的解剖标志如图2A所示。
  2. 将肠道移向一侧,找到下腔静脉(图2A)。使用弹簧剪在下腔静脉上做一个小的横向切口,以释放肝血管压力(图2Bi)。
  3. 按照步骤1.2.4–1.2.6所述方法暴露胆总管和门静脉。
  4. 使用磷酸盐缓冲液(PBS)润湿的棉签将肠道和胰腺移至操作者的右侧。
  5. 用PBS润湿的棉签将肝脏腹侧翻向心脏方向,以暴露脏面及肝门区域。
  6. 找到从肝门区穿过胰腺并延伸至壶腹括约肌处肠道的胆总管(图2Bii,黄色虚线标示胆总管轮廓,黑色箭头指向壶腹括约肌)。
    注意:操作过程中务必通过滴加PBS保持肝脏湿润。
  7. 使用直镊清除胆总管周围组织(范围约5 mm)。将丝线缝合线(4-0号,0.17 mm,长3–5 cm)置于胆总管下方(图2Bii),并在胆总管周围打一个松散的单结(图2Biii)。
    注意:选择打结位置时应位于肝门区与壶腹括约肌之间的中点,并远离门静脉,以确保收紧缝线后不会干扰门静脉注射。
  8. 将弹簧剪平贴于胆总管,在胆总管进入胰腺和肠道邻近壶腹括约肌处做一斜行切口(图2Biv,黄色虚线标示壶腹括约肌区域,黑色箭头强调该区域)。
    注意:此步骤至关重要。必须做斜行而非横向切割,仅做切口而不要切断胆总管。若完全切断胆总管,将导致导管插入极为困难。
  9. 使用前立即取1 mL黄色树脂与50 µL固化剂混合(通过填充并排空1 mL注射器数次),然后将树脂与固化剂的混合物装入1 mL鲁尔注射器中。
  10. 将装满混合物的注射器连接导管(1号套装)。推动活塞,完全充满导管,确保树脂/固化剂混合物从导管末端滴出。
    注意:为获得最佳效果,请避免并清除注射器和导管中的气泡。
  11. 用镊子拉直胆总管切口周围区域,将导管插入胆总管开口处(图2Bv),使斜面尖端的长边朝下,指向胆总管背侧。此方向可确保树脂从朝上的导管开口顺利流入胆管内(图2Bv)。
  12. 收紧丝线结,固定导管于胆总管内(图2Bvi)。
  13. 向胆总管内注射树脂。观察胆囊及各个肝叶的填充情况。
  14. 用PBS润湿的棉签轻柔按摩肝脏,帮助树脂均匀分布。在野生型小鼠中,树脂填充的胆管终末分支在肝脏表面可隐约可见。
    注意:预期肝脏完全填充时间为30–100秒。
  15. 当肝脏表面出现树脂小点(图2Ci,蓝色箭头)或感到明显阻力时,停止注射。
    注意:由于加入固化剂后树脂开始硬化,操作应尽可能迅速。自加入固化剂起,有效操作时间约为15分钟。
  16. 将导管从胆总管中拔出,并立即用镊子收紧丝线结,防止树脂泄漏。剪除丝线多余部分,以免干扰后续门静脉注射。
  17. 将含有树脂的导管、剩余树脂弃置于危险废物容器中,针头弃置于锐器废物容器中。

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结果

导管测量装置,带有比例尺的导管尖端(PE10、PE50)显微图像,用于尺寸比较。
图1:树脂铸型用注射装置。A)注射装置#1由一支30 G针头和长约30 cm的PE10导管组成。注射装置#2由一支23 G针头和长约30 cm的PE50导管组成。(B)导管末端被拉伸并斜向剪切,以形成斜面尖端。A和B中的尺子为厘米尺,主刻度间隔为1 cm,中间刻度间隔为5 mm,次级刻度间隔为1 mm。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 安全密封微量离心管  Sarstedt72.706
带导管的 23 G 蝴蝶针 BD bioscience367283
23 G 针头  BD bioscience305892
30 G 针头 BD bioscience305106
琼脂糖  Top-BioP045
苯甲醇Sigma Aldrich108006
苯甲酸苄酯  Sigma AldrichB6630
Corning 50 mL 离心管  Sigma AldrichCLS430829-500EA 聚丙烯
棉签 Medicarier 60406
解剖显微镜  Leica Camera AGLeica M60
杜尔贝科磷酸盐缓冲液  ThermoFisher Scientific14190144
70% 乙醇  VWR83801.41
Falcon 15 mL 管 Verkon 331.850.084.006
弯头镊子 Fine Science Tools 11051-10 精细 Graefe 10 cm 弯头
直头镊子 Fine Science Tools 11050-10精细 Graefe 10 cm 直头
甲醛溶液  Sigma AldrichF8775
汉克斯平衡盐溶液 ThermoFisher Scientific14025092
肝素 Leo Pharma B01AB01 5000 IE/mL
异氟烷 Baxter FDG9623
甲醇  ThermoFisher Scientific11413413
MICROFIL   FlowtechMV-122黄色合成树脂
MICROFIL  FlowtechMV-120 蓝色合成树脂
MICROFIL FlowtechMV-diluent 透明树脂稀释剂
巴斯德移液管 Verkon 130.690.424.503
蠕动泵  AgnThos010.6131.M20
摇床 VWR 444-0142
丝线缝合线  AgnThos14757黑色丝线,4-0,无菌,100 m
皮肤剪刀   Fine Science Tools14058-09直头虹膜剪,9 cm
弹簧剪刀   Fine Science Tools15000-03Vannas 微型剪,直头,2 mm
1 mL 鲁尔注射器  BD bioscience303172
PE10 导管 BD bioscience427401
PE50 导管 BD bioscience 427411

标签

微型计算机断层扫描胆总管三维结构胆管聚合反应