胆道系统树脂铸型：利用不透射线树脂注射分析小鼠模型胆道系统三维结构的技术 关键词：胆道系统，树脂铸型，三维结构，小鼠模型，不透射线树脂，放射成像

摘要

来源：Hankeova, S. 等. DUCT：双重树脂铸型结合显微计算机断层扫描用于肝脏三维分析. J. Vis. Exp. (2021)

本视频介绍了胆道系统树脂铸型的操作流程，以帮助理解胆道系统的三维结构。该技术可提供胆道系统内径大小及网络连接情况的信息，可用于肝脏再生分析。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会的审核。

1. 双重树脂注射

1. 准备
   1. 准备树脂溶液。对于双系统树脂注射，按照步骤 1.1.2–1.1.4 所述方法分别准备黄色和绿色树脂。
   2. 每只小鼠准备 1 mL 稀释后的树脂分装液。
   3. 黄色树脂：将黄色硅橡胶（高放射不透性）与透明稀释剂按 3:1 比例稀释，以制备用于注射的黄色树脂。
   4. 绿色树脂：将蓝色硅橡胶（无可检测的放射不透性）与透明稀释剂按 1:1 比例混合，制备蓝色树脂。为生成绿色树脂，将稀释后的蓝色树脂与稀释后的黄色树脂按 1:1 比例混合。充分涡旋震荡绿色树脂，直至颜色均匀。
      注意： 蓝色树脂的放射不透性极低，在微计算机断层扫描（microCT）中无法检测，因此必须与黄色树脂混合，以制备出具有不同放射不透性的两种树脂。
      警告： 树脂可能含有铬酸铅，属于致癌物，在火灾中会产生有毒气体。请小心操作，并将树脂作为危险废物处理。
   5. 按照步骤 1.1.6–1.1.11 所述方法，准备两套注射装置（注射装置 #1 和注射装置 #2），并连接导管。
      注意： 对于成年小鼠（>P30（出生后第 30 天）= P30 至 2 年龄），使用注射装置 #1（外径 0.6 mm 的 PE10 导管）进行胆总管注射，使用注射装置 #2（外径 0.96 mm 的 PE50 导管）进行门静脉注射。对于幼年出生后小鼠（不超过 P30），准备两套 #1 注射装置，分别用于胆管和门静脉注射（无需使用注射装置 #2，因为门静脉过窄，无法容纳 PE50 导管）。
   6. 制备注射装置 #1：剪取 30 cm 长的 PE10 导管，用手拉伸导管一端，使其尽可能变细（图 1A、B，拉伸后直径约 0.15 mm，未拉伸的 PE10 导管直径为 0.6 mm）。
   7. 将拉伸后的 PE10 导管末端斜向剪切，形成斜面尖端（图 1B）。
   8. 将 PE10 导管未拉伸的一端连接至 30 G 针头（图 1A，注射装置 #1）。
   9. 制备注射装置 #2：剪取 30 cm 长的 PE50 导管，用手拉伸导管一端，使其足够细，以便插入门静脉（图 1A、B，拉伸后直径约 0.7 mm，未拉伸的 PE50 导管直径为 0.96 mm）。
   10. 将拉伸后的 PE50 导管末端斜向剪切，形成斜面尖端（图 1B）。
   11. 将 PE50 导管未拉伸的一端连接至 23 G 针头（图 1A，注射装置 #2）。
       注意： 每套注射装置仅可用于一次注射，因为树脂会在注射器和导管内固化。根据小鼠年龄、基因型和表型对应的胆总管和门静脉大小，调整拉伸和斜面尖端的尺寸。若不确定导管尺寸是否合适，可在切开后、向导管填充树脂前，先将导管插入相应导管或血管中测试。若导管过宽无法插入，应进一步拉伸。
   12. 通过吸入异氟烷麻醉动物（诱导室中初始浓度为 4%，随后通过鼻罩维持约 2%）。
   13. 将小鼠置于解剖垫上的通风操作台上，使其通过鼻罩吸入异氟烷。采用机构或机构审查委员会（IRB）推荐的方法确认动物已失去意识，例如轻捏一只脚掌。
       警告： 吸入异氟烷可能导致嗜睡或头晕，长期或反复暴露可能对心血管系统和中枢神经系统造成损害。切勿吸入。应在通风操作台及通风良好的区域操作该物质。
       注意： 可使用其他麻醉方法，只要其与心脏灌注兼容即可。
   14. 动物失去意识后，用 70% 乙醇喷洒腹部表面，以防止毛发干扰。
   15. 使用皮肤剪刀从腹腔正中线开始，切开皮肤、筋膜和肌肉层，直至胸腔，以暴露内脏器官。
   16. 用镊子夹住剑突，抬起胸骨，并在两侧剪开膈肌和肋骨，以暴露心脏和肺。
   17. 用剪刀剪断左右两侧肋骨，移除肋骨笼。操作时需格外小心，避免损伤肝脏，否则会导致树脂泄漏。
   18. 用直头镊子将心脏向肝脏方向牵拉，并剪除右心房。
   19. 将连接至蠕动灌注泵的蝴蝶针（23 G）插入左心室。通过汉克斯平衡盐溶液（HBSS）和肝素（1 U/g 小鼠体重）进行心脏灌注，灌注速率为 5 mL/min，持续 3 分钟。
       注意： 若灌注正确，内脏器官将变得苍白，尤其是肝脏。若肺部变白，则说明针头插入了右心室，需重新调整位置。灌注完成后，小鼠已放血，可将其从鼻罩和异氟烷中移出。
   20. 关闭异氟烷泵。

2. 树脂灌注——胆道系统树脂铸型

1. 将小鼠移至解剖显微镜下，腹部朝上，尾部朝向操作者，头部远离操作者。感兴趣的解剖标志如图2A所示。
2. 将肠道移向一侧，找到下腔静脉（图2A）。使用弹簧剪在下腔静脉上做一个小的横向切口，以释放肝血管压力（图2Bi）。
3. 按照步骤1.2.4–1.2.6所述方法暴露胆总管和门静脉。
4. 使用磷酸盐缓冲液（PBS）润湿的棉签将肠道和胰腺移至操作者的右侧。
5. 用PBS润湿的棉签将肝脏腹侧翻向心脏方向，以暴露脏面及肝门区域。
6. 找到从肝门区穿过胰腺并延伸至壶腹括约肌处肠道的胆总管（图2Bii，黄色虚线标示胆总管轮廓，黑色箭头指向壶腹括约肌）。
   注意：操作过程中务必通过滴加PBS保持肝脏湿润。
7. 使用直镊清除胆总管周围组织（范围约5 mm）。将丝线缝合线（4-0号，0.17 mm，长3–5 cm）置于胆总管下方（图2Bii），并在胆总管周围打一个松散的单结（图2Biii）。
   注意：选择打结位置时应位于肝门区与壶腹括约肌之间的中点，并远离门静脉，以确保收紧缝线后不会干扰门静脉注射。
8. 将弹簧剪平贴于胆总管，在胆总管进入胰腺和肠道邻近壶腹括约肌处做一斜行切口（图2Biv，黄色虚线标示壶腹括约肌区域，黑色箭头强调该区域）。
   注意：此步骤至关重要。必须做斜行而非横向切割，仅做切口而不要切断胆总管。若完全切断胆总管，将导致导管插入极为困难。
9. 使用前立即取1 mL黄色树脂与50 µL固化剂混合（通过填充并排空1 mL注射器数次），然后将树脂与固化剂的混合物装入1 mL鲁尔注射器中。
10. 将装满混合物的注射器连接导管（1号套装）。推动活塞，完全充满导管，确保树脂/固化剂混合物从导管末端滴出。
    注意：为获得最佳效果，请避免并清除注射器和导管中的气泡。
11. 用镊子拉直胆总管切口周围区域，将导管插入胆总管开口处（图2Bv），使斜面尖端的长边朝下，指向胆总管背侧。此方向可确保树脂从朝上的导管开口顺利流入胆管内（图2Bv）。
12. 收紧丝线结，固定导管于胆总管内（图2Bvi）。
13. 向胆总管内注射树脂。观察胆囊及各个肝叶的填充情况。
14. 用PBS润湿的棉签轻柔按摩肝脏，帮助树脂均匀分布。在野生型小鼠中，树脂填充的胆管终末分支在肝脏表面可隐约可见。
    注意：预期肝脏完全填充时间为30–100秒。
15. 当肝脏表面出现树脂小点（图2Ci，蓝色箭头）或感到明显阻力时，停止注射。
    注意：由于加入固化剂后树脂开始硬化，操作应尽可能迅速。自加入固化剂起，有效操作时间约为15分钟。
16. 将导管从胆总管中拔出，并立即用镊子收紧丝线结，防止树脂泄漏。剪除丝线多余部分，以免干扰后续门静脉注射。
17. 将含有树脂的导管、剩余树脂弃置于危险废物容器中，针头弃置于锐器废物容器中。

结果

图1：树脂铸型用注射装置。（A）注射装置#1由一支30 G针头和长约30 cm的PE10导管组成。注射装置#2由一支23 G针头和长约30 cm的PE50导管组成。（B）导管末端被拉伸并斜向剪切，以形成斜面尖端。A和B中的尺子为厘米尺，主刻度间隔为1 cm，中间刻度间隔为5 mm，次级刻度间隔为1 mm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 安全密封微量离心管  	Sarstedt	72.706
带导管的 23 G 蝴蝶针 	BD bioscience	367283
23 G 针头  	BD bioscience	305892
30 G 针头	 BD bioscience	305106
琼脂糖  	Top-Bio	P045
苯甲醇	Sigma Aldrich	108006
苯甲酸苄酯 	 Sigma Aldrich	B6630
Corning 50 mL 离心管  	Sigma Aldrich	CLS430829-500EA	 聚丙烯
棉签 	Medicarier 	60406
解剖显微镜  	Leica Camera AG	Leica M60
杜尔贝科磷酸盐缓冲液  	ThermoFisher Scientific	14190144
70% 乙醇  	VWR	83801.41
Falcon 15 mL 管 	Verkon	 331.850.084.006
弯头镊子 	Fine Science Tools	 11051-10	 精细 Graefe 10 cm 弯头
直头镊子 	Fine Science Tools	 11050-10	精细 Graefe 10 cm 直头
甲醛溶液 	 Sigma Aldrich	F8775
汉克斯平衡盐溶液 	ThermoFisher Scientific	14025092
肝素	 Leo Pharma 	B01AB01	 5000 IE/mL
异氟烷 	Baxter 	FDG9623
甲醇  	ThermoFisher Scientific	11413413
MICROFIL   	Flowtech	MV-122	黄色合成树脂
MICROFIL  	Flowtech	MV-120 	蓝色合成树脂
MICROFIL 	Flowtech	MV-diluent	 透明树脂稀释剂
巴斯德移液管 	Verkon 	130.690.424.503
蠕动泵  	AgnThos	010.6131.M20
摇床 	VWR 	444-0142
丝线缝合线  	AgnThos	14757	黑色丝线，4-0，无菌，100 m
皮肤剪刀  	 Fine Science Tools	14058-09	直头虹膜剪，9 cm
弹簧剪刀   	Fine Science Tools	15000-03	Vannas 微型剪，直头，2 mm
1 mL 鲁尔注射器 	 BD bioscience	303172
PE10 导管 	BD bioscience	427401
PE50 导管 	BD bioscience 	427411