从小鼠模型中分离窦房结：一种从小鼠心脏获取窦房结的实验方法

摘要

来源：Kumar, P 等，利用微电极阵列记录窦房结放电频率以鉴定小鼠内在心脏起搏功能缺陷。J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了从小鼠心脏中分离窦房结（SAN）的操作步骤。窦房结内含有窦房结细胞，可通过产生自发性动作电位来启动心跳。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 窦房结（SAN）的解剖分离

1. 准备用于窦房结（SAN）分离的肝素化完全台氏液。
   1. 在40 mL完全台氏液中加入400 µL肝素（1,000 USP/mL），并在37 °C水浴中预热。
2. 通过腹腔注射向小鼠注射200–300 μL肝素（1000 USP/mL），并让动物静置10分钟。
3. 通过过量吸入异氟烷处死已肝素化的小鼠。
   1. 将小鼠放入一个小的玻璃容器中，容器内含有由将200–300 μL液态异氟烷滴加至穿孔塑料管内的滤纸上所产生的异氟烷蒸气。
      注意：由于异氟烷可能引起皮肤刺激并可通过皮肤吸收，因此液体不应直接接触小鼠。故应将浸有异氟烷的擦拭物置于穿孔管中进行给药。
   2. 通过运动和呼吸停止以及脚趾夹捏反射消失来确认死亡。通常在放入容器后约1–2分钟内死亡。
      注意： 死亡通常伴随排尿现象。
4. 将小鼠仰卧固定在解剖板上，四肢伸展，并使用1英寸长、23号规格的注射针头将四肢固定在板上。然后使用手术剪刀从肋骨下缘根部剪除周围毛发。
   注意：解剖板可使用聚苯乙烯保温箱盖。
5. 用止血钳夹住皮肤，使用手术剪刀在肋骨下缘稍下方做一横向切口，从左侧肋弓至右侧肋弓（图1A）。
6. 用手术剪刀切开腹膜，并小心将肝脏与膈肌分离，注意不要划破肝脏，以免引起大量出血（图1B）。沿胸廓切开膈肌以暴露胸腔（图1C–D）。
7. 使用手术剪刀从肋弓边缘向上沿肋骨侧壁剪至锁骨，以暴露心脏，注意避免损伤心脏（图1D）。然后使用23号注射针头将肋骨固定于肩部上方，使其远离手术区域并保持固定。
8. 使用移液管滴加温热（37 °C）的肝素化完全台氏液至心脏表面，以保持其湿润。
   注意：切勿让心脏干燥。
9. 用超细Graefe镊子夹住肺部，用手术剪刀切断气管以移除肺（图1E）。
10. 用超细Graefe镊子夹住心尖，用手术剪刀切断主动脉和上下腔静脉以取下心脏。将心脏转移至含有固化硅胶弹性体的培养皿中（图2A），并用移液管加入2–3 mL温热（37 °C）的肝素化完全台氏液冲洗心脏。
    注意：操作时需小心，避免损伤右心房后壁及其相连的静脉，因窦房结（SAN）位于此处。用完全台氏液冲洗心脏可防止其干燥，但切勿将心脏完全浸没于溶液中，以免影响解剖过程中的视野清晰度。
11. 将心脏定向，使右心房位于实验者右侧，左心房位于实验者左侧。
    注意：为防止缺血性损伤，应尽快完成窦房结组织的解剖。
12. 用解剖针将心尖固定于培养皿中。然后用Dumont #2椎板切除镊子夹住下腔静脉，将22 G注射针头穿过下腔静脉和上腔静脉，以确定其在右心房中的位置，从而大致定位窦房结（SAN）的位置（位于上、下腔静脉之间的组织区域）（图2B）。
13. 使用小型解剖针将左、右心耳固定于培养皿中。
    1. 用Dumont #2椎板切除镊子夹住左心耳，插入一根解剖针穿过左心耳以固定其位置。
    2. 用Dumont #55镊子夹住右心耳，插入一根解剖针穿过右心耳以固定其位置。
       注意：如需要，也可使用同类型镊子夹持左、右心耳。
14. 移除贯穿上下腔静脉的注射针头。
15. 为排出心脏内血液，使用Castroviejo剪刀在心室水平做横向切口，切除心尖部分（即下半部分）（图2C）。然后用移液管加入温热（37 °C）的肝素化完全台氏液清洗心脏。
16. 使用Castroviejo剪刀沿房室隔膜剪开，切口应更靠近心室而非心房。继续沿房室隔膜剪切，直至将心房与心室完全分离。
17. 沿房间隔剪开以移除左心房。
18. 在右心房周围插入解剖针，使其展平（图2D）。使用Castroviejo剪刀清除残留的脂肪、血管或其他组织。
19. 在右心房中定位窦房结（SAN），在此方位下，其大致边界为上方的上腔静脉、下方的下腔静脉以及左侧的终嵴（图2D）。
    ​注意：终嵴表现为右心耳与窦房结之间的一条深色肌性隆起。通常还可观察到窦房结动脉穿行于窦房结组织中（图2D）。

结果

图1：心脏的取出。（A）在肋骨下缘稍下方的皮肤做横向切口，从左侧肋弓至右侧肋弓。（B）腹膜切口。（C,D）沿胸腔切开膈肌，以暴露胸腔。（E）切除肺脏后取出心脏。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
22 号注射器针头	Fisher Scientific	14-826-5A	用于解剖
23 号注射器针头	Fisher Scientific	14-826-6C	用于解剖
60 mm 培养皿	Genesee Scientific	32-105G
Castroviejo 剪刀，4"	Fine Science Tools	15024-10
解剖显微镜	Jenco
解剖针	Fine Science Tools	26002-20
Dumont #2 脊椎切除镊	Fine Science Tools	11223-20
Dumont #55 镊子	Fine Science Tools	11295-51
 超细 Graefe 镊	Fine Science Tools	11152-10
止血钳	Fine Science Tools	13013-14
肝素	Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram	NDC 63739-953-25
Sylgard 弹性体试剂盒	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
手术剪	Fine Science Tools	14074-09
移液管（3 mL 带刻度）	Samco Scientific	225
异氟烷 	Patterson Veterinary 	07-893-1389