小鼠模型中的连续给药系统：在小鼠脑内植入微型渗透泵给药系统的外科手术操作，用于实现持续药物递送

摘要

来源：Ajoy, R., Chou, S. Y. 利用小鼠脑部连续药物输注系统研究下丘脑胰岛素信号与外周葡萄糖耐受不良的关系。J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们演示了微型渗透泵脑部输注系统的组装，以及其在小鼠颅骨中的手术植入。该系统可实现潜在药物的持续递送，有助于研究这些药物对脑组织及脑功能的影响。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 微渗透泵输注系统的制备

注意：在无菌条件下准备泵、人工脑脊液（aCSF）缓冲液和药物（Met-CCL5/RANTES 蛋白溶液（10 ng/mL 溶于 aCSF）），使用经 0.2 µm 滤器过滤的缓冲液，并在超净工作台内戴手套进行所有操作。手术步骤如下：

1. 手术前一天准备微型渗透泵：使用试剂盒中提供的1 mL注射器和钝头针将人工脑脊液（aCSF）注入脑用微型渗透泵内。将微型渗透泵浸入aCSF中，置于摇床上轻轻振荡过夜。
   注意：应使用aCSF填充泵体，并避免泵内产生气泡（图1A）。
2. 开始手术前，配制实验用的重组Met-CCL5/RANTES蛋白溶液（10 ng/mL，用aCSF稀释）。将泵中的aCSF排出，缓慢注入药物溶液，直至有过量液体渗出。
   备注：15 mL的aCSF或Met-CCL5/RANTES溶液足以填充5–8个泵。
   注意：重复操作以确保泵内完全充满药物且无气泡残留。
3. 将导管剪成所需长度，并与脑灌注试剂盒中的钝头脑灌注针连接。用药物溶液充满灌注试剂盒及导管。
4. 最后，将脑灌注装置组装并连接至微型渗透泵。
   注意：导管或泵内均不应产生气泡（图1A）。
5. 将整个渗透泵-脑融合装置浸没于装有aCSF的无菌50 mL离心管中，防止泵体干燥。此时，渗透泵-脑融合装置已准备好用于手术。
   备注：微型渗透泵系统可用于长期药物灌注，为向小鼠脑内递送药物提供了一种安全且便捷的方式。

2. 脑室内手术——微型渗透泵的植入

注意：使用75%乙醇对手术环境进行灭菌，并确保参与研究的人员佩戴无菌手套和清洁的实验服。手术器械/工具在使用前必须经过高压灭菌并干燥，并在每只小鼠手术之间用75%乙醇再次灭菌。

1. 称重小鼠，并通过腹腔注射（IP）给予氯胺酮/赛拉嗪（氯胺酮 50 mg/kg，赛拉嗪 10 mg/kg）进行麻醉。
   警告小鼠体重低于24 g时不建议进行渗透泵植入手术。
2. 将小鼠头部固定在立体定位仪上图1B).
3. 使用手术剪和镊子剪开覆盖颅骨的外层皮肤。用碘液清洁颅骨周围区域。
4. 使用钝头镊子在颈部区域将最外层皮肤与皮下组织分离，以便进行渗透泵-脑融合装置的植入图1C).
5. 参照脑图谱标记灌注点（图1D) 使用立体定位仪。在此实验中，需要将针头植入 3^rd 脑室区域（前囟：0.0 mm 水平，1.3 mm 后方，5.7 mm 腹侧）。
6. 使用指甲钻在颅骨标记区域周围钻孔（图1E).
   注意注意避免撕裂小鼠脑膜和血管，从而防止脑内微血管的损伤。
7. 将含有aCSF（作为对照）或药物（Met-CCL5/RANTES蛋白溶液）的微型渗透泵-脑融合装置置于颈部后方皮下，并将脑部输注针插入钻孔中，以将药物输注至小鼠脑内图1E）。针头将穿透脑膜并进入脑室。使用表面脱敏凝胶将针头固定在颅骨上图1F）并等待1-2分钟，直至胶水干燥。接着，剪去针头顶部突出的部分（图1G- H)
8. 使用组织粘合胶来闭合头部手术切口。在伤口上涂抹50 µL粘合胶，将皮肤两侧拉拢并保持30秒，使皮肤充分闭合。图1I).
   警告：手术后使用100%酒精棉片清洁伤口，并使用100 μl青霉素-链霉素防止感染。 注意小鼠皮肤在使用外科胶水后将形成瘢痕组织，并在数天内愈合。该胶水的主要优势在于避免了外科缝合，从而防止可能由缝线引起的皮肤刺激或炎症。
9. 将小鼠放入置于预热至37°C温热板上的清洁笼盒中，等待小鼠从麻醉效应中恢复。
   警告保持小鼠体温对于提高术后存活率至关重要。
10. 经过一周的恢复期后，小鼠即可用于后续实验，例如口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素耐量试验（ITT）。

结果

图1. 小鼠渗透压泵制备及植入手术步骤。（A） 脑部灌注套件及泵的准备，以药物溶液进行灌注。红色箭头指示充满液体的导管。 （B） 将小鼠头部固定并安装到立体定位仪上。 (C) 将皮肤最外层与皮下组织分离，以便植入微型渗透泵-脑部输注装置；虚线表示渗透泵的植入位置。 （D） 箭头指示输注侧。 (E) 在颅骨标记区域周围钻孔。 (F) ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Vetbond 组织粘合剂 	3M 	#1049SB 	用于封闭小鼠头部损伤部位的胶水
LOCTITE 454 瞬干胶 	Durect Corporation 	#8670 	用于将针头固定在小鼠颅骨上的胶水
Alzet 微渗透泵 	Durect Corporation 	#9922 	0.11 μl 每小时，持续 28 天
脑部输注系统 	Durect Corporation 	#8851 	1–3 mm，用于向小鼠脑内灌注药物
MIO NE116 控制单元（指甲钻） 	Mio System 	#E235-015 	用于在小鼠颅骨上钻孔
aCSF 配方 	119 mM NaCl     26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl               1 mM NaH2PO4   1.3 mM MgCl2       10 mM 葡萄糖 		使用 0.22 μm 滤器装置过滤除菌，并在 4°C 下保存。aCSF 可稳定保存 3–4 周