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所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 手术与颅骨环的安装
注意： 小鼠固定装置的完整组件包括4个部分：一个块体和一块平板、一个用于固定小鼠头部的环形部件，以及一根用于将环形部件固定在块体上的螺钉（图1A）。该固定装置的所有部件均通过i.materialise.com进行3D打印获得。平板由丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）聚合物制成，块体和螺钉由不锈钢制成，环形部件由高等级不锈钢（高精度不锈钢）制成（尺寸详见图2，3D打印文件见材料部分）。块体永久固定在支撑板上，可通过螺钉或胶合方式固定。一旦将环形部件固定在小鼠颅骨上，应将其用螺钉固定至块体支架上（图1A）。
- 用浸有70%乙醇的纸巾湿润头皮上的毛发以进行消毒。用湿润的纸巾清除所有松动的毛发。
注意：为方便操作，可在手术前剃除头皮毛发。
- 使用无菌精细剪刀和镊子，在头顶正中线至耳间区域做T形切口（长度约1 cm），暴露颅骨。
注意：环状固定装置将覆盖额骨和顶骨区域（图1B）。
- 使用无菌镊子暴露颅骨。用剪刀和镊子小心去除骨膜。使用浸有生理盐水的无菌棉签彻底清除所有骨膜残留、碎屑或毛发，以免影响成像质量。
注意：为减少炎症反应，操作时应避免损伤骨组织。
- 用生理盐水冲洗残留血液，并迅速用干燥棉签将骨面擦干。将胶水凝胶涂抹于环状装置上，将其置于暴露的颅骨表面并保持数秒，确保环牢固粘附于颅骨。
注意：胶水不得进入观察区域，否则可能导致不必要的自发荧光。
- 用浸有生理盐水的棉签轻轻湿润颅骨表面。
- 按1:1比例仔细混合蓝色和黄色组分，制备硅基牙科胶。将牙科胶均匀涂抹于环状装置周围以实现密封，防止成像过程中发生泄漏。仔细清除进入环内的任何牙科胶或胶水残留。
- 用生理盐水填充环内空间，检查是否存在泄漏。
注意：生理盐水作为显微镜物镜的浸没介质。在具有止血功能缺陷的小鼠中，出血问题可能更为显著。必须防止血液进入环内，以免影响后续成像清晰度。
- 将小鼠置于支撑装置上，并将环状装置旋紧固定于支架（图1C）。在动物头部下方垫入折叠的纱布以抬高头部，防止环从颅骨脱落。
注意：头部被直接固定，可避免因呼吸运动导致的图像位移。
- 将支撑装置与小鼠整体置于加热的显微镜腔室中（图1D）。
注意：操作过程中需始终注意避免移位已插入的导管。
