活体成像：通过稳定成像窗口在细胞水平观察小鼠胰腺的方法

摘要

来源：Park, I. 和 Kim, P. 稳定化纵向 体内 利用胰腺活体成像窗口在小鼠模型中实现胰腺的细胞水平可视化 视频实验杂志 (2021).

在本视频中，我们介绍了通过稳定窗口对小鼠胰腺进行活体成像，以实现对细胞动态的长期可视化观察。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 活体成像

1. 开启活体显微镜及其激光电源。
2. 打开加热垫，并将恒温控制系统设置为 37 °C。
   注意： 若无恒温控制系统，可改用被动式加热垫或加热灯，并需频繁监测温度。
3. 取一只已预先植入胰腺观察窗的小鼠，通过肌肉注射给予替来他明/唑拉西泮（30 mg/kg）与赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。
   注意： 推荐使用替来他明/唑拉西泮而非氯胺酮，因后者可引起高血糖等不良反应。应根据实验目的选择最适宜的麻醉方案。
4. 插入血管导管以供注射。
   1. 用食指和中指压迫尾部近端，以替代止血带；必要时可用灯加热尾部。
   2. 用70%乙醇喷雾对尾静脉进行消毒。
   3. 将30 G导管插入尾侧静脉，可在PE10导管中观察到血液反流。
   4. 用丝线固定导管以保持稳定。
   5. 根据所用荧光探针的组合，适当注射FITC/TMR葡聚糖或其他荧光探针（如25 µg Alexa 647标记的抗CD31抗体）。
      注意： 若使用荧光标记抗体探针，建议在成像前2小时注射。
5. 将小鼠从手术平台转移至成像载物台。
6. 插入直肠探头，通过恒温加热系统自动控制体温。
7. 将胰腺成像窗插入活体显微镜系统准备好的窗夹中（图1）。对于倒置显微镜，可能无需使用窗夹。
8. 进行活体成像。
   1. 对胰腺进行成像时，首先使用低倍物镜（例如4x）扫描胰腺观察窗内的整个胰腺视野（推荐视野范围：2500 x 2500 µm）。
   2. 确定感兴趣区域后，切换至更高倍物镜（20x或40x）进行细胞水平成像（推荐视野范围：500 x 500 µm 或 250 x 250 µm）。本实验中，横向和轴向分辨率分别约为0.5 µm和3 µm。
   3. 进行z轴层扫或延时成像，以观察三维结构或细胞水平动态过程（如细胞迁移）。
      注意： 对表达荧光蛋白的转基因动物（MIP-GFP）进行成像时，间歇性使用488 nm激光（功率最高达0.43 mW），每次照射30秒，未观察到明显光漂白或组织损伤。对Alexa 647标记的荧光蛋白进行成像时，640 nm激光功率最高达0.17 mW亦可耐受，无明显光漂白或光毒性损伤。若激光激发时间过长或功率超过上述设定，可能导致光漂白或光毒性引起的组织损伤。应根据感兴趣区域调整合适的增益和激光功率。活体显微成像的具体参数设置需根据各研究机构所配置的设备进行个性化优化。

结果

图1：胰腺活体成像窗口安装示意图。 将胰腺活体成像窗口植入小鼠体内，并将其固定于XYZ平移台中，成像室支架连接至倾斜支架后，再与胰腺成像窗口相连。© 2020 韩国糖尿病学会，《糖尿病与代谢杂志》（Diabetes Metab J）2020年 第44卷 第1期 第193–198页。经韩国糖尿病学会许可转载。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 647 琥珀酰亚胺酯（NHS 酯）	 Invitrogen	 A20006	 用于与抗体偶联的荧光探针
BD Intramedic 聚乙烯导管	 BD Biosciences	 427401	 用于与针头连接的 PE10 导管
C57BL/6N	 OrientBio	 C57BL/6N	 C57BL/6N
圆形盖玻片	 Marienfeld	 0111520	 用于胰腺成像窗的盖玻片
FITC 葡聚糖 2MDa	 Merck（原 Sigma Aldrich）	 FD200S	 用于血管识别
IMARIS 8.1	 Bitplane	 IMARIS	 图像处理
活体显微镜	 IVIM tech	 IVM-C	 活体显微镜
MIP-GFP	 The Jackson Laboratory	 006864	 B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J
胰腺成像窗	 Geumto Engineering	 定制订单	 胰腺成像窗 - 定制订单
Physiosuite	 Kent Scientific	 PS-02	 恒温控制器
TMR 葡聚糖 65-85kDa	 Merck（原 Sigma Aldrich）	 T1162	 用于血管识别
窗片固定器	 Geumto Engineering	 定制订单	 窗片固定器 - 定制订单
Zoletil	 Virbac	 Zoletil 100	 麻醉剂
Rompun 	Bayer 	Rompun 	麻醉剂