活体成像:一种通过稳定成像窗口对小鼠胰腺进行细胞水平观察的方法

摘要

来源:Park， I. 和 Kim， P. 具有胰腺活体成像窗口的小鼠模型中胰腺的稳定纵向体内细胞水平可视化。J. Vis. Exp. （2021 年）。

在本视频中，我们描述了通过稳定窗口对小鼠胰腺进行活体成像，以长期可视化细胞动力学。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 活体成像

1. 打开活体显微镜，包括激光功率。
2. 打开加热垫，将恒温调节设置为 37 °C.
   注意:或者，如果没有恒温调节，请使用被动加热垫或频繁控制的灯。
3. 以预先植入胰窗的小鼠为例。使用平拉他明/唑拉西泮 （30 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （10 mg/kg） 的混合物进行肌内麻醉><。 注意:建议使用平他胺/唑拉西泮代替氯胺酮，因为它对高血糖有不利影响。应为实验目的选择最佳麻醉。
4. 插入血管导管进行注射。
   1. 用食指和无名指在尾巴的近端施加压力，作为止血带应用的替代方案。如果需要，用灯加热尾巴。
   2. 用 70% 乙醇喷雾剂对尾静脉进行消毒。
   3. 将 30 G 导管插入外侧尾静脉。血液反流将在 PE10 管中可视化。
   4. 在导管上贴上丝带以稳定它。
   5. 根据荧光><探针的组合，酌情注射 FITC/TMR 葡聚糖或其他荧光探针（25 μg 抗 CD31 与 Alexa 647 偶联）。 注意:对于荧光偶联抗体探针，在成像前 2 小时注射。
5. 将鼠标从手术平台转移到成像台。
6. 插入直肠探头，使用恒温加热垫系统自动控制体温。
7. 将胰腺成像窗口插入在活体显微镜设置期间准备的窗口支架中（图 1）。对于倒置显微镜，可能不需要窗口支架。
8. 进行活体成像。
   1. 对于胰腺成像，从低倍率物镜（例如 4 倍）开始，用于在胰腺成像窗口中扫描胰腺的整个视图（推荐视野:2500 x 2500 μm）。
   2. 确定感兴趣区域后，切换到更高放大倍率的物镜（20 倍或 40 倍）进行细胞水平成像（推荐视野:500 x 500 μm 或 250 x 250 μm）。在本实验中，横向和轴向分辨率分别约为 0.5 μm 和 3 μm。
   3. 执行 z 堆栈或延时成像以观察 3D 结构或细胞水平动力学，例如细胞迁移><。 注意:对于转基因动物表达荧光蛋白的细胞 （MIP-GFP） 的成像，可以耐受 30 秒的间歇性 488 nm 激光曝光，功率高达 0.43 mW，而不会出现明显的光漂白或组织损伤。对于用 Alexa 647 标记的荧光蛋白进行成像，可以容忍高达 0.17 mW 的 640 nm 激光功率，而不会出现明显的光漂白或组织损伤。如果功率高于此设置，则长时间激发激光曝光可能会导致光漂白或光毒性引起的组织损伤。调整足够的增益和功率，以适当地对感兴趣区域进行成像。活体显微镜中参数的详细设置必须针对研究所准备的每种活体显微镜进行个体化。

结果

图 1:胰腺活体成像窗口实施的照片。在 XYZ 平移阶段将胰腺活体成像窗口植入小鼠中，并且连接到倾斜支架的成像室支架连接到胰腺成像窗口。版权所有 2020 韩国糖尿病协会，来自 Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198。经韩国糖尿病协会许可转载。

材料