顺行灌注模型：一种用于离体小鼠心脏灌注的离体实验技术

摘要

来源：Omatsu-Kanbe, M. 等，一种从小鼠中分离心肌细胞的顺行灌流方法。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频介绍了一种对离体小鼠心脏进行顺行灌注的技术，其中灌注液通过左心室注入，最终灌注整个心肌。该方法可用于从小鼠模型中分离心肌细胞，并制备脱细胞心脏，以用于后续的下游应用。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小鼠心脏的顺行灌注

注意： 用于吸取心脏的塑料移液管应质地柔软，且尖端不应过于尖锐。选择带有锯齿的小型血管夹。推荐使用的器械见材料表。

1. 小鼠心脏的切除与主动脉夹闭
   注意： 应通过腹腔注射（i.p.）过量戊巴比妥钠（>300 mg/kg）联合肝素（8000 单位/kg）处死成年小鼠（>8 周龄）。
   1. 通过吸管快速吸出小鼠心脏
      1. 迅速打开胸腔以暴露心脏。剪切塑料移液管，使其尖端大小与暴露的心脏相近或略小（通常在距 0.5 mL 刻度约 1 cm 向尖端方向处剪断，但具体位置取决于心脏大小）。
      2. 将心脏吸入移液管中，抬高移液管以留出足够空间插入剪刀，然后从背侧使用弯头剪刀切除心脏，注意避免损伤心房。
      3. 立即将切除的心脏转移至含有冰浴 CIB-EGTA 的 30 mL 玻璃烧杯中，以终止收缩。该操作通常耗时 <1 分钟。
   2. 主动脉周围组织的清理
      1. 将心脏转移至盛有冰浴 CIB-EGTA 的 35 mm 培养皿中，去除肺组织及其他可见组织，然后将初步清理后的心脏转移至盛有冷 CIB-EGTA 的心脏支架中，并使心尖朝下放置。
      2. 在体视显微镜下，清除主动脉周围的脂肪和结缔组织。若切断的主动脉过长，包含无名动脉、左颈总动脉或左锁骨下动脉，则在无名动脉下方剪断主动脉以缩短其长度，以便进行下一步操作。该操作通常耗时约 4 分钟。
   3. 夹闭主动脉并将夹闭后的心脏置于灌流板上
      1. 插入注射针头并开始灌流以排出血液
         1. 在显微镜下，将心脏置于心脏支架中。操作者应面对心脏的前表面，用镊子夹住主动脉末端，并在轻轻下压主动脉的同时，使用小型血管夹在靠近心房处夹闭主动脉。
         2. 将夹闭后的心脏前表面朝上放置于灌流板上，然后滴加数滴 CIB-EGTA 覆盖心脏，防止其干燥。该操作通常耗时 <20 秒。
      2. 心脏顺行灌流
         注意： 首先使用 CIB-EGTA 灌流心脏，以排出血液并防止凝血。
         1. 插入注射针头并开始灌流以排出血液
            1. 将装有预热 CIB-EGTA 的 20 mL 注射器连接至柔性延长管和标记的注射针头，并安装于输液泵上。以 0.5 mL/min 的低速启动泵，小心地用 CIB-EGTA 填充针头和管道，确保无空气进入管路。
            2. 将注射针头放置于灌流板上，使对角线较短的一侧朝前。将针头向心尖方向滑动直至接触心脏，然后小心地将针头插入左心室心尖附近的心室腔内，避免旋转针头。在插入过程中切勿将针头从板上取下。
            3. 观察红色标记以估计针头插入深度。当针头插入完成后，冠状动脉中流出的血液应开始被排出。
            4. 用胶带将注射针头固定在板上，并将泵速提高至 1 mL/min。该操作通常耗时约 30 秒。若心脏成功灌流，在显微镜下可观察到心外膜下方毛细血管中 CIB-EGTA 的流动。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
延伸管	Top, Japan	X1-50	用于连接注射器和注射针，进行顺行灌注。
加热垫	Natsume Seisakusho, Japan	KN-475-3-40	用于加热灌注板的设备。
输液泵	TERUMO, Japan	TE-311	用于顺行灌注的注射器输液泵。
注射针（27 号）	TERUMO, Japan	NN-2719S	用于插入左心室。
胰岛素（牛胰来源）	Sigma-Aldrich, USA	I5500	溶于 0.1 M HCl 中。
塑料注射器（20 mL）	TERUMO, Japan	SS-20ES	用于输注 CIB-EGTA。
血管夹	Karl Hammacher GmbH, Germany	HSE 004-35	小型直型血管夹，用于夹闭主动脉。
其他所有试剂	Nacalai Tesque, Japan