小鼠肺动脉瓣膜的加压固定：一种在闭合构象下分离并化学固定的实验方法

摘要

来源：Liu, Y. 等。小鼠肺动脉瓣相关成像的手术与样本处理。J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们描述了通过灌注加压法将小鼠肺动脉瓣固定在闭合构象并进行化学固定的分离步骤。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 肺动脉瓣切除术

1. 对小鼠解剖所需工具进行高压灭菌，包括精细剪刀、显微镊子、显微血管夹、持夹镊子、显微持针器、弹簧剪和牵开器。
2. 手术前至少将所有小鼠适应环境两周。取出约1年龄的C57BL/6小鼠，从笼中取出后称重，并通过过量注射氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮:赛拉嗪 = 3:1，每克体重0.01 mL）实施安乐死。
3. 将小鼠仰卧位固定于托盘上，用胶带固定四肢。固定后进行开胸操作。
   1. 清除多余脂肪组织和筋膜，暴露心脏。
   2. 切除右心房，并通过左心室以室温生理盐水（0.9% NaCl）进行灌注。灌注量约为20 mL，持续约30秒，以实现小鼠完全放血。
4. 切断上腔静脉、下腔静脉、肺动脉和主动脉，完整取出心脏。操作肺动脉时需格外小心。在心室-动脉连接处上方约2 mm处剪断，该残端将作为后续加压的通路。
5. 切除左心室和右心室，使心腔暴露于大气压下。注意确保切除心室过程中肺动脉干结构不受影响。

2. 肺动脉瓣压力固定

1. 将加压导管与肺动脉进行吻合，使窦-管交界处与导管末端之间保留约1 mm的距离，以适应瓣叶和肺动脉干的大幅度运动。
2. 将储液器抬升至相应的生理压力水平，并用生理盐水充满。测试流通系统，确保无堵塞或气泡存在。
3. 在吻合的肺动脉瓣上连接一个三通阀，通过切换流出道确保导管内有充分的液体流动（即无气泡）。当流动充分后，将流出道切换至吻合的肺动脉瓣，确保肺动脉干被加压。可通过观察肺动脉干扩张来确认加压成功。
4. 一旦确认肺动脉干已加压，逐步引入固定液（1.25% 戊二醛，1.0% 多聚甲醛溶于0.15 M卡考基酸盐缓冲液）以置换生理盐水。具体操作为移除约25%储液器容量的生理盐水，并替换为初始固定液。
   注意：所使用的固定剂（多聚甲醛和戊二醛）具有高度毒性，应穿戴适当的个人防护装备（PPE）以确保安全。
5. 用浸有固定液的纱布覆盖组织样本，防止干燥。
6. 持续灌注固定液3小时，根据需要补充储液器以维持恒定压力。在固定过程中，由于化学固定作用，肺动脉瓣发生收缩是常见现象。若出现此情况，需持续补充初始固定液以维持生理压力。
7. 将心脏瓣膜置于4 °C的固定液中保存备用。样本保存时间最长可达1周，未观察到明显差异。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25% 戊二醛（水溶液）	EMS	16210	主要固定剂组分
0.9% 氯化钠注射液	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
1 mL 注射器	BD	309659
10 mL 注射器	BD	309604
22G 针头	BD	305156
三通旋塞阀	Smiths Medical ASD, Inc	MX5311L
4% 多聚甲醛（水溶液）	EMS	157-4-100	主要固定剂组分
C57BL/6 小鼠	Jackson Laboratories	664	约 1 岁
持钳止血钳	FST	00072-14
Dumont #5 镊子	FST	11251-20
Dumont #5/45 镊子	FST	11251-35
Dumont #7 细镊	FST	11274-20
精细剪刀	FST	14028-10
生理盐水溶液（无菌 0.9% 氯化钠）	Hospira Inc	NDC 0409-0138-22
手术显微镜	Leica	M80
Tish 持针器/镊子	Micrins	MI1540
修毛器	Wahl	9854-500
黑色聚酰胺单丝缝线，10-0	AROSurgical instruments Corporation	TI38402
黑色聚酰胺单丝缝线，6-0	AROSurgical instruments Corporation	SN-1956
盐酸氯胺酮注射液	Hospira Inc	NDC 0409-2053
L-天冬氨酸	Sigma-Aldrich	56-84-8	染色组分
硝酸铅	EMS	17900	染色组分
二甲胂酸钠三水合物	Sigma-Aldrich	6131-99-3	缓冲液
无纺纱布	McKesson Corp.	94442000
显微 Adson 镊	FST	11018-12
Millex-GP 滤器，0.22 µm，PES 33 mm，非无菌	EMD Millipore	SLGP033NS