小鼠幼崽白色与棕色脂肪组织库的采集：一种获取小鼠幼崽白色脂肪组织和棕色脂肪组织的手术操作

摘要

来源：Galmozzi, A. 等. 从新生小鼠中分离与分化原代白色和棕色前脂肪细胞。 实验视频杂志. 实验版 (2021)

在本视频中，我们演示了从新生小鼠分离皮下白色脂肪组织和肩胛间棕色脂肪组织的手术操作过程。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 脂肪组织库的采集与消化（第1天）

1. 为每只幼鼠准备两个1.5 mL离心管：一个用于棕色脂肪组织（BAT），另一个用于白色脂肪组织（WAT）。向每管中加入250 µL磷酸盐缓冲液（PBS）和200 µL 2倍分离缓冲液（123 mM NaCl、5 mM KCl、1.3 mM CaCl₂、5 mM葡萄糖、100 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、青霉素-链霉素和4%无脂肪酸牛血清白蛋白）。保持溶液无菌并置于冰上。
2. 将幼鼠放入小容器中（例如6孔板中的一个孔），并将其置于冰上直至出现低体温。确保幼鼠与冰之间无直接接触。用枪头刺破足垫以确认意识丧失，并使用锋利剪刀通过断头法处死幼鼠。
   注意：若处理不同基因型的小鼠，需额外准备一个离心管以收集尾部活检样本（剪取约3 mm），用于基因分型。若立即进行基因分型，则将处死后的幼鼠置于冰上，直至解剖以收集脂肪组织库。
3. 计算并称取消化所有脂肪库所需的胶原酶用量。向每管中加入50 µL浓度为15 mg/mL的I型胶原酶（溶于2倍分离缓冲液中）。在所有组织收集完成前，不要将胶原酶重新悬浮于分离缓冲液中。
4. 为收集皮下WAT，沿幼鼠腹部切开皮肤（避免刺破腹膜），并轻轻将皮肤向下拉至腿部以下。在不取下皮肤的情况下，小心采集脂肪库，该组织呈透明（P1或更小）或白色（P2及以上）、薄而细长，附着于股四头肌内侧或上方（图1A、B）。用PBS冲洗脂肪库后，将其放入含有250 µL PBS + 200 µL 2倍分离缓冲液的离心管中，并置于冰上。
   注意：P0和P1小鼠可获得最佳产量。在P0-1幼鼠中，皮下WAT库几乎透明；而在P2及以上小鼠中，该库更容易识别，因其已变为白色，表明存在完全成熟且富含脂滴的白色脂肪细胞。
5. 为收集肩胛间BAT，将肩胛区域的皮肤拉过头部。提起肩胛骨之间的深红色组织（即BAT），并在其周围小心剪开，使其与身体分离（图1A、B）。检查其一致性和颜色；用PBS冲洗；放入另一含有250 µL PBS + 200 µL 2倍分离缓冲液的离心管中；并置于冰上。
   注意：从P2及以上小鼠中采集BAT时，应仔细去除环绕BAT的白色脂肪组织。该组织为一层位于皮肤与BAT之间的薄而柔软的白色脂肪细胞层，在肩胛骨之间位置更深。

结果

图 1：脂肪垫的采集与处理。（A）原代白色（上图）和棕色（下图）脂肪细胞分离的示意图。（B）皮下白色（上图）和棕色（下图）脂肪组织库。在出生后第0天（P0）的小鼠中，皮下WAT几乎不可见，但在出生后约第2天开始变得可辨识。相比之下，BAT即使在P0时也具有明显的深色。在较年长的幼鼠中，BAT被一层薄的表层WAT包围，解剖组织时需要去除该层。（C）经过100 µm细胞筛过滤、初始洗涤后以及分离后24小时的原代白色和棕色前体细胞的代表性图像。比例尺 = 100 µm。缩写：WAT = white adipose tissue；BAT = ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔板	Corning	353046
游离脂肪酸BSA	Sigma-Aldrich	A8806
CaCl<sub>2</sub>	Sigma-Aldrich	C4901
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）	Gibco	15140122
外科镊子	ROBOZ 外科器械公司	RS-5158
外科剪刀	ROBOZ 外科器械公司	RS-5880
不含钙、镁离子的DPBS	&nbsp;Gibco&nbsp;	14190144