小鼠回肠环模型：一种用于研究小鼠肠道通透性的外科手术模型

摘要

来源：Boerner, K., 等. 利用标准化肠段模型对小鼠肠道通透性及中性粒细胞跨上皮迁移进行功能评估。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了在小鼠模型中建立回肠袢模型以研究肠道通透性的方法。该方法提供了一种活体模型，用于理解上皮屏障功能及其引发的免疫反应。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 回肠袢的制备

1. 皮肤准备：用酒精棉片或浸有70%乙醇的纱布海绵擦拭腹部中线的毛发。避免用酒精浸湿大面积毛发，以防发生低体温。
2. 使用剪刀进行腹正中切口。在腹部中央做一垂直切口（长约2 cm），暴露腹膜。操作时注意避免损伤腹腔内器官。
3. 将预先剪好并润湿的棉纱布覆盖在暴露的腹腔上。
4. 使用湿润的棉签游离并外置盲肠。小心地将盲肠放置在湿润的棉纱布上。
   注意： 在大多数小鼠中，盲肠位于腹腔的左后象限，与动物性别无关。
5. 使用湿润的棉签游离并轻柔地外置回肠，其末端（远端）与盲肠相连（图1B）。
6. 将至少6 cm的末端回肠展布于湿润棉纱布上，注意不要破坏肠系膜血管及其血液供应。若无出血且组织保持粉红色，则表明血供良好（图1B）。
   注意： 使用预接黄色饲管的10 mL注射器，每隔2–3分钟用温热的HBSS润湿组织，以防止暴露组织干燥。
7. 靠近盲肠处，辨认肠系膜中为回肠供血的主要动脉。随后在肠系膜上选择两个无重要血管穿行的结扎位点。
8. 使用钝头组织镊牢固夹住末端回肠（靠近盲肠端），再用精细镊子在避开血管的区域对肠系膜进行穿孔。将丝线穿过穿孔处并打外科结，完成第一处结扎（环的远端）。
9. 使用直尺测量距第一处结扎4 cm的位置，按步骤2.8所述方法建立第二处结扎（环的近端）（图1C）。
10. 用精细剪刀小心地在每处结扎线旁剪断，以分离出4 cm长的回肠环，同时保持血液供应和肠系膜膜的完整。
    注意： 剪除外置iLoop段的两端后，需轻柔冲洗，此步骤可清除管腔内容物（如粪便物质）的干扰，有助于FITC-葡聚糖或趋化刺激物在整个隔离肠段内均匀分布，并提高流式细胞术对白细胞定量的准确性。此外，该操作可在注入指定体积试剂后实现黏膜的均匀扩张，增强动物间实验的可重复性。
11. 使用连接10 mL注射器的柔软黄色饲管，以温热的HBSS轻柔冲洗回肠环段内的内容物。
12. 使用丝线结扎已冲洗的回肠环两端的切口。
13. 使用1 mL注射器配30 G针头，缓慢向肠腔内注射250 µL试剂（如FITC-葡聚糖或趋化因子）。回肠环将膨胀，导致黏膜出现中度扩张（图1D）。
    注意： 应在肠系膜动脉对侧的肠环腔内注射试剂。注射时注意避免将回肠环从动物体内拉出，以防撕裂血管引起出血。
14. 使用湿润棉签，轻柔地将回肠环、近端回肠和盲肠复位。
15. 使用持针器、解剖镊及带反向切割针的3.0不可吸收丝线缝合腹壁。
16. 将动物置于温控麻醉舱内，进行孵育。

结果

图1： 回肠襻模型。（A）回肠襻模型的示意图。在麻醉状态下对小鼠进行正中开腹手术，并将其置于温度可控的手术台上。（B）盲肠（*）、回肠及肠系膜的外翻。确定两个合适的结扎位点（1,2）。（C）分离一段4 cm长的肠段：第一结扎点（1）位于回盲交界处附近，第二结扎点（2）距离第一结扎点4 cm。（D）在肠系膜上做两个小切口（1, 2），形成一段4 cm长的回肠襻。清除肠腔内容物并结扎断端后，可将荧光标记物和趋化因子等试剂注入肠腔。回肠襻血供良好（黑色箭头）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器与材料
BD 酒精棉片	BD	326895
BD PrecisionGlide 针头，25G × 5/8"	BD	305122
BD PrecisionGlide 针头，30G × 1/2"	BD	305106
BD 1 ml 结核菌素注射器（无针头）	BD	309659
15 ml 离心管	Corning	14-959-53A
Corning 96 孔实底黑色聚苯乙烯微孔板	FisherScientific	07-200-592
Corning 未处理培养皿，10 cm	MilliporeSigma	CLS430588
棉签（棉拭子），6"，无菌	FisherScientific	25806 2WC
Dynarex 棉垫纱布海绵，非无菌，2" × 2"	Medex	3249-1
EZ-7000 麻醉蒸发器（经典系统，含加热单元）	E-Z Systems	EZ-7000
Moria 精细剪刀	FST	14370-22
Puralube Vet 眼用软膏，无菌眼润滑剂	Dechra	12920060
环形镊（钝组织镊）	FST	11103-09
Roboz 外科 4-0 黑色编织丝线，100 码	FisherScientific	NC9452680
Semken 镊子（解剖镊）	FST	1108-13
Sofsilk 不可吸收涂层黑色编织丝线，3-0 规格，18"，针长 19 mm，3/8 圆弧反向切割 	HenrySchein	SS694
学生用精细弯头镊	FST	91110-10
10 ml 注射器（PP/PE 材质，无针头）	Millipore Sigma 	Z248029
黄色啮齿类喂食管，20G × 30 mm	Instech	FTP-20-30
溶液与缓冲液
Hanks' 平衡盐溶液	Corning	21-023-CV
不含钙和镁的磷酸盐缓冲液	Corning	21-040-CV
异氟烷	Halocarbon	12164-002-25