小鼠近端结肠袢模型的生成:一种通过检测腔内注射后血清中的荧光标志物来生成近端结肠袢并测量肠道通透性的外科手术

摘要

来源:Boerner， K. et al. 使用标准化肠袢模型对小鼠肠道通透性和中性粒细胞跨上皮迁移进行功能评估。J. Vis. Exp. （2021）。

在本视频中，我们描述了一种外科手术，以产生小鼠近端结肠环或 pcLoop 段，然后将荧光标志物腔内注射到该段中，以研究肠上皮通透性。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 近端结肠环的生成 （pcLoop）

1. 皮肤准备:用酒精棉签或浸泡了 70% 乙醇的纱布海绵擦洗腹部中线的皮毛。不要用酒精弄湿大面积的皮毛，以防止体温过低。
2. 使用剪刀进行中线剖腹手术。在腹部中间（约 2 厘米长）做一个垂直切口，露出腹膜。小心不要伤害腹腔内器官。
3. 将预先剪好的湿棉纱布放在暴露的腹腔上。
4. 使用湿棉签动员盲肠并使其外侧。小心地将盲肠放在湿棉纱布上。
   注意: 盲肠位于大多数小鼠腹腔的左尾象限，与动物的性别无关。
5. 使用湿棉签将整个回肠外露，并将其放在湿棉纱布的顶部。确定位于结肠系膜的近端结肠和血液供应。动员近端结肠，并使用细尖镊子在距盲肠约 0.5 cm 的结肠系膜中没有血管的区域创建第一条结扎线（图 1B）。
6. 从第一根结扎线测量 2 厘米，并在结肠系膜中没有血液供应的区域创建第二根结扎线（图 1C）。
7. 使用细剪刀在每个连接旁边小心剪断，以分离出 2 cm 长的 pcLoop.
   注意:在每个结扎处小心剪下细剪刀以隔离 4 cm 回肠袢，保持完整的血液供应和肠系膜，重要的是要切断两端以隔离轻轻清洁管腔内容物的 pcLoop。小心切开结肠组织和结肠系膜，以防止小血管出血到肠腔。如有必要，使用热烧灼术限制切口部位的出血。
8. 使用连接到 10 mL 注射器的柔性黄色饲管，用温热的 HBSS 轻轻冲洗 pcLoop，以去除粪便（准备 10 mL 装满温热 HBSS 的注射器，并连接到黄色饲管。该注射器将用于在手术期间滋润暴露的组织）。
9. 使用丝缝合线连接冲洗的 pcLoop 的两个切割端。
10. 使用带有 1 G 针头的 30 mL 注射器缓慢注入 200 μL 试剂，例如 FITC-葡聚糖（HBSS 中为 1 mg/mL）。将未使用的 FITC-葡聚糖溶液避光保存，以便在血清采集后制备标准曲线）。pcLoop 会膨胀，导致粘膜中度膨胀（图 1D><）。 注意:将试剂注射到肠系膜动脉对侧的 pcLoop 管腔中。确保动物之间的一致性，并创建一个 2 cm 长的 pcLoop 以确保粘膜的均匀膨胀。
11. 使用湿棉签轻轻地将结扎的 pcLoop、回肠和盲肠放回腹腔。
12. 使用持针器、解剖钳和 3.0 不可吸收蚕丝缝合线和反向切割针来闭合腹壁。
13. 将动物置于温度调节的麻醉室中孵育。

结果

图 1:近端结肠袢模型。（A） pcLoop 模型的原理图概述。正中剖腹手术是在放置在温控手术板上的麻醉下的小鼠上进行的。（B） 盲肠 （*）、近端结肠、结肠系膜和回肠的外化。确定了两个合适的连接位点 （1,2）。（C） 第一根结扎线 （1） 靠近盲肠放置，第二根结扎线 （2） 放置在距离第一根结扎线 2 cm 处。（D） 将 pcLoop 外化，去除管腔内容物，并用荧光标记物和化学引诱剂等试剂充气。pcLoop 是近端结肠血管化良好的 2 cm 段（黑色箭头表示血液供应）。

材料