小鼠近端结肠袢模型的建立：一种通过肠腔内注射荧光标记物并检测血清中荧光信号以评估肠道通透性的外科手术方法

摘要

来源：Boerner, K. 等。利用标准化肠段模型对小鼠肠道通透性及中性粒细胞跨上皮迁移进行功能评估。J. Vis. Exp. (2021)。

在本视频中，我们介绍了一种用于构建小鼠近端结肠袢（pcLoop）节段的外科手术方法，随后向该节段进行管腔内注射荧光标记物，以研究肠道上皮通透性。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 近端结肠袢（pcLoop）的构建

1. 皮肤准备：用酒精棉片或浸有70%乙醇的纱布海绵擦拭腹部中线处的毛发。避免用酒精浸湿大面积毛发，以防发生低体温。
2. 使用剪刀进行腹正中切口。在腹部中央做一垂直切口（长约2 cm），暴露腹膜。操作时注意避免损伤腹腔内器官。
3. 将预先剪好并润湿的棉纱布覆盖在暴露的腹腔上。
4. 用湿润的棉签将盲肠游离并外翻，小心地将盲肠置于湿润的棉纱布上。
   注意：在大多数小鼠中，盲肠位于腹腔左后象限，且与动物性别无关。
5. 使用湿润的棉签将整个回肠外翻，并放置在湿润棉纱布上方。辨认近端结肠及其位于结肠系膜中的血供。游离近端结肠，并使用精细镊子在结肠系膜无血管区域（距盲肠约0.5 cm处）打第一个结扎（图1B）。
6. 从第一个结扎处量取2 cm，在结肠系膜无血管区域打第二个结扎（图1C）。
7. 使用精细剪刀小心地在每个结扎线旁剪断，以分离出一段长2 cm的pcLoop。
   注意：使用精细剪刀小心地在每个结扎线旁剪断，以分离出一段长4 cm的回肠袢，同时保持血供和肠系膜膜完整；必须将两端切断，以分离出一段pcLoop，并轻柔清除管腔内容物。剪切结肠组织和结肠系膜时应小心操作，防止小血管出血进入肠腔。如有必要，可使用热凝止血法控制切口部位出血。
8. 使用连接10 mL注射器的柔软黄色饲管，以温热的HBSS轻柔冲洗pcLoop以清除粪便（准备一支装有温热HBSS的10 mL注射器，并连接黄色饲管。该注射器将在手术过程中用于保持暴露组织的湿润）。
9. 使用丝线缝合结扎已冲洗的pcLoop的两个断端。
10. 使用带30G针头的1 mL注射器缓慢注入200 μL试剂（如FITC-葡聚糖（1 mg / mL溶于HBSS中））。未使用的FITC-葡聚糖溶液需避光保存，以便在血清采集后绘制标准曲线。pcLoop将膨胀，导致黏膜中度扩张（图1D）。
    注意：将试剂注射至肠系膜动脉对侧的pcLoop管腔内。应确保各动物间操作一致，并制备长度为2 cm的pcLoop，以保证黏膜扩张程度均一。
11. 使用湿润棉签轻柔地将结扎后的pcLoop、回肠和盲肠复位至腹腔内。
12. 使用持针器、解剖镊和带反向切割针的3.0不可吸收丝线缝合腹壁。
13. 将动物放入温度可控的麻醉舱内，进行孵育期观察。

结果

图1：近端结肠环模型。（A）pcLoop模型的示意图。在麻醉状态下，将小鼠置于温度可控的手术台上，进行正中开腹术。（B）盲肠（*）、近端结肠、结肠系膜及回肠的暴露。确定两个合适的结扎位点（1,2）。（C）第一道结扎（1）靠近盲肠，第二道结扎（2）位于第一道结扎远端约2 cm处。（D）将pcLoop拉出体外，清除管腔内容物，并注入荧光标记物或趋化因子等试剂使其膨胀。pcLoop为一段血供良好的2 cm长近端结肠组织（黑色箭头指示血液供应）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器与材料
BD 酒精棉片	BD	326895
BD 1ml 结核菌素注射器（无针头）	BD	309659
BD PrecisionGlide 针头，25G × 5/8"	BD	305122
BD PrecisionGlide 针头，30G × 1/2"	BD	305106
棉签（棉棒），6"，无菌	FisherScientific	25806 2WC
Dynarex 棉垫纱布海绵，非无菌，2" × 2"	Medex	3249-1
EZ-7000 麻醉蒸发器（经典系统，含加热单元）	E-Z Systems	EZ-7000
Kimwipes 小号擦拭纸（组织擦拭纸）	FisherScientific	06-666
Moria 精细剪刀	FST	14370-22
Puralube Vet 眼用软膏，无菌眼润滑剂	Dechra	12920060
环形镊子（钝头组织镊）	FST	11103-09
Roboz 外科 4-0 黑色编织丝线，100 码	FisherScientific	NC9452680
Semken 镊子（解剖<br/> 镊）	FST	1108-13
Sofsilk 不可吸收涂层黑色缝合线，编织丝线，规格 3-0，18"，针长 19mm，3/8 圆弧反向切割针	HenrySchein	SS694
学生用精细弯头镊子	FST	91110-10
10ml 注射器 PP/PE 材质（无针头）	Millipore Sigma	Z248029
试剂
异氟烷&nbsp;	Halocarbon&nbsp;	12164-002-25
异硫氰酸荧光素-葡聚糖，平均分子量 4.000	Sigma	60842-46-8