肌纤维分离：从小鼠趾长伸肌（EDL）中获取单根肌纤维的技术

摘要

来源：Hüttner, S.S. 等 单肌纤维培养实验用于体外评估成年肌肉干细胞功能。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了从小鼠趾长伸肌（EDL）中分离单根肌纤维的方法。分离得到的肌纤维可用于培养，以研究与肌纤维相关的肌肉干细胞活性。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. EDL 肌肉的分离与胶原酶消化

1. 使用70%乙醇喷洒所有设备，以避免污染。
2. 根据国家动物实验相关规定处死小鼠。
3. 用70%乙醇喷洒小鼠后肢。使用硬化精细弯剪（24 mm切割刃）和精细镊子（Dumont 7，弯头或直头）去除皮肤，暴露下方肌肉。避免下方肌肉与毛发接触（会增加污染风险）。
4. 使用精细弯头镊子去除周围筋膜，注意不要损伤下方肌肉（图1A）。操作时闭合镊子，以防弯曲。
5. 用弯头镊子暴露趾长伸肌（TA，tibialis anterior）和趾外展肌（EDL）的远端肌腱。要切除TA肌，用镊子夹住TA远端肌腱，并用精细Vannas弹簧剪（5 mm切割刃，0.35 mm尖端直径）剪断。在夹住TA肌腱的同时，将其向膝关节方向牵拉，并在靠近膝关节处剪断肌肉（图1B），此时EDL肌已暴露。
   注意：确保此步骤中仅夹住TA肌腱，否则可能损伤下方的EDL肌。切除TA肌时，应确保之后能清楚看到膝关节处的肌腱。
6. 用精细弯头镊子提起EDL远端肌腱，并用精细Vannas弹簧剪剪断（图1C）。通过轻柔地将EDL向膝关节方向牵拉，暴露其近端肌腱。用精细Vannas弹簧剪剪断近端肌腱。将EDL肌转移至含有2.5 mL预热至37°C的胶原酶消化液的15 mL离心管中。胶原酶消化液配制方法如下：
   1. 将0.2%（w/v）I型胶原酶（来源于Clostridium histolyticum）溶解于DMEM（含4.5 g/L葡萄糖和丙酮酸钠的Dulbecco改良Eagle培养基）中，经0.22 µm滤膜过滤。（图1D）。
      注意：在外侧膝关节结缔组织处做一小切口，以充分暴露EDL近端肌腱。操作时确保仅夹持肌腱，不要过度拉伸EDL肌。
7. 对另一侧EDL肌重复步骤1.3至1.6。将两个EDL肌均加入同一支含有2.5 mL胶原酶消化液的15 mL离心管中。
8. 将EDL肌置于37°C水浴振荡器中孵育。
   注意：孵育时间取决于多种因素，如胶原酶活性、小鼠年龄及纤维化组织含量。成年小鼠（2–6月龄）EDL肌的典型孵育时间为1–1.5小时，老年小鼠（18月龄）为1.5–2小时。
9. 为避免肌肉过度消化，在消化过程中定期检查肌肉状态。当肌肉松散、可见单个肌纤维时，停止消化（图1E）。用大孔径移液枪小心地将肌肉转移至预热的12孔板的第一个孔中，孔内含肌纤维分离培养基（图1G），该培养基配制方法如下：
   1. 在DMEM（含4.5 g/L葡萄糖和丙酮酸钠的Dulbecco改良Eagle培养基）中添加20% FBS（胎牛血清），经0.22 µm滤膜过滤。在分离前约30分钟，将培养基加入预先包被的分离板（12孔板，每孔2–4 mL分离培养基），并在37°C、5% CO₂的湿润培养箱中平衡。

2. 肌纤维解离

1. 在进行以下步骤时，使用体视显微镜，最好配备加热板（37 °C）。用大口径移液管将温热的分离培养基冲洗肌肉组织，直至单个肌纤维被释放。用大口径移液管继续吹打分散肌肉组织，直到获得所需数量的游离单肌纤维。
   注意：避免过度吹打，以降低肌纤维损伤的风险。强烈建议在肌纤维分离过程中使用加热板，因为在分离过程中温度下降会导致肌纤维死亡。

结果

图1. 小鼠EDL肌解剖及单个肌纤维分离。 （A）去除小鼠后肢皮肤，并剥离包裹肌肉的筋膜，以暴露胫前肌（tibialis anterior）。（B）移除胫前肌以暴露趾长伸肌（extensor digitorum longus），白色箭头所示为EDL肌。（C）通过切断肌腱分离EDL肌。（D）两块EDL肌进行胶原酶消化。（E）胶原酶消化后的肌肉外观，可见单个肌纤维从组织核心松解出来。（F）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
I型胶原酶	Sigma	C0130
DMEM（Dulbecco）’s 改良的 Eagle’s 培养基含 4.5 g/l 葡萄糖和丙酮酸钠	GibCo	41966029	细胞培养基
胎牛血清	Gibco	10270-106	胎牛血清