细菌性眼内炎小鼠模型：通过玻璃体内注射细菌悬液建立小鼠细菌性眼内炎的方法 关键词：细菌性眼内炎，小鼠模型，玻璃体内注射，细菌悬液，眼感染，实验性眼病

摘要

来源：Mursalin, M. H. 等，细菌性眼内炎小鼠模型中玻璃体内注射及感染参数的定量分析。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频介绍了一种通过将细菌悬液注射到小鼠眼内玻璃体腔中，建立模拟细菌性眼内炎的小鼠模型的方法。细菌性眼内炎是一种由细菌侵入眼内玻璃体腔引起的内部感染。该小鼠模型有助于研究疾病的发病机制并评估潜在的治疗方法。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 无菌玻璃针

1. 打开针式移液器拉制仪的电源。
2. 调节加热器旋钮，直至显示屏显示数值为12.6。
3. 打开门，手动将5 μL毛细管穿过上部夹具并穿过加热丝，使管子的一半长度延伸至加热丝下方（图1A）。
4. 确认毛细管已置于上部夹具的“V”形槽内，然后拧紧上部夹具。
5. 在下部夹具打开的状态下，手动向上调节垂直滑块，直至下部夹具达到其上限位置。确认毛细管位于下部夹具的“V”形槽内，然后拧紧下部夹具。
6. 关闭门，确认“准备就绪”指示灯亮起。按下启动按钮，以启动加热和拉制程序（图1B）。
7. 确保加热器在加热和重力作用将毛细管拉断后自动关闭（图1C），且滑块向下移动。
8. 打开门，握住毛细管上端，松开上部夹具，取下上段毛细管并放置一旁。
9. 握住底部滑块中的毛细管，松开下部夹具，取下下段毛细管并放置一旁。
10. 使用配备0.05 μm氧化铝研磨板的微电极斜面研磨仪，对拉制后的毛细管进行斜面打磨，以制成注射针头。
11. 将足量水滴加到研磨板上，使其覆盖整个表面（图1D）。
12. 打开研磨仪电源，使其以60 rpm转速开始旋转。将拉制后的毛细管放入“V”形槽中的移液管夹具内，拧紧夹具，并将移液管夹具的角度调节至30°。
13. 将毛细管尖端调整至距离研磨板旋转中心约三分之二半径的位置。
14. 通过调节操纵器顶部的粗调控制旋钮，降低已夹紧的毛细管。持续下移毛细管，直至其尖端伸入水面以下并接触研磨板的研磨表面。
15. 使用连接在研磨仪上的显微镜监测斜面打磨过程。5分钟后，调节微调控制装置，将玻璃针头从研磨板表面抬起。
16. 取下玻璃针头，置于10倍放大镜下检查毛细管尖端（图1E,F）。
17. 为确保无堵塞，将玻璃针头插入连接注射器的移液管 holder 中，向装有1 mL 99%乙醇的试管内推动空气。若针尖处形成气泡，则表明针头无堵塞，可用于显微注射。此过程同时可确保玻璃针头的无菌性。
18. 一根毛细管最多可容纳5 μL液体。将毛细管均分为10段，以计算针管上对应0.5 μL体积的刻度间距。标记出每0.5 μL对应的长度，以便后续使用。对于5 μL针管，每0.7 mm的间距相当于0.5 μL（图1G）。

2. 小鼠玻璃体内注射

1. 本节所有操作均须在生物安全二级条件下进行。
2. 在手术台上放置医用垫巾以准备操作区域。
3. 转动 开启 打开连接至显微注射仪的压缩空气罐上的气体阀门。调节气罐调压阀，使气体输送压力约为60 psi。
4. 在显微注射仪上按下 模式 直到屏幕显示 平衡. 按压 平衡 将计算机鼠标放置在手术台上。将不锈钢移液管架连接到与注射器“填充/输出”端口相连的管路上。该管路始终与注射器保持连接。
5. 将毛细玻璃针插入移液器 holder 的另一端，通过拧紧移液器 holder 连接头固定针头。
6. 打开眼科显微镜，将光源强度调至50%。调整显微镜至手术台操作区域上方，并调节显微镜至所需焦距。
7. 在开始操作前，通过检测小鼠的足底回缩反射确认其已充分麻醉。务必遵循经IACUC批准的麻醉操作规程。
8. 将麻醉后的小鼠置于医用垫巾上，使其鼻部朝右，左侧身体侧倾倚靠。
9. 通过眼科显微镜观察小鼠右眼，并用反向持针钳夹住眼睛两侧的镊柄张开眼睑，以暴露注射部位（图 2C).
10. 用毛细管针吸取 Bacillus cereus （ATCC 14579）菌液（200 CFU/μL 稀释度），通过点击显微注射仪连接的鼠标左键图 2D).
11. 用左手固定动物头部，将针头尖端置于眼睛的角膜缘处。针头斜面朝上，与眼球呈45°角刺入小鼠眼内，注射时确保仅针头锐利部分（约0.5 mm）插入眼内。
12. 针尖插入后，将左手从鼠头移至鼠标垫，右键点击鼠标垫以注入 0.5 μL 的 B. cereus 用脑心浸液（BHI）肉汤制备的稀释液。为防止渗漏，在拔出前将针头尖端留在小鼠眼内2-3秒。图 2E).
13. 松开镊子，将小鼠放入置于加热垫上的笼子中。持续观察小鼠，直至其从麻醉状态恢复图2F).
14. 小鼠从麻醉中恢复后，将鼠笼放回相应的架位。若小鼠需接受视网膜电图检测以分析视网膜功能，应将鼠笼放回暗室，以确保充分的暗适应。

结果

图1：制备斜面玻璃针。 玻璃针由一次性微毛细移液管通过拉针仪和微移液管斜面仪制成。(A) 将玻璃毛细管夹持在拉针仪中。(B,C) 使用设定电压拉制玻璃针。(D) 对玻璃微移液管进行斜面加工。(E,F) 斜面处理前后的玻璃微移液管。(E) 玻璃针的刻度：两个黑点之间的空间容纳 0.5 µL。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞显微注射仪 	MicroData Instrument, Inc. 	PM2000 	NA
5 微升微量毛细移液管 	Kimble 	71900-5 	NA
微量移液管斜面研磨仪	 Sutter Instrument Co. 	BV-10	NA
OPMI Lumera 显微镜 	Zeiss 		NA
反向操作镊子 	Katena 	K5-8228	NA