细菌性眼内炎小鼠模型:一种通过玻璃体内注射细菌悬浮液到小鼠眼中产生细菌性眼内炎的方法

摘要

来源:Mursalin， M. H. et al.， 细菌性眼内炎小鼠模型中玻璃体内注射和感染参数的定量。J. Vis. Exp. （2021 年）。

该视频介绍了一种生成小鼠模型的方法，该模型模拟细菌眼内炎（一种由细菌侵入眼睛玻璃体腔引起的眼内感染），方法是将细菌悬浮液注射到眼睛中。这种小鼠模型有助于研究疾病机制并评估其治疗方法。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 无菌玻璃针

1. 打开针式移液器拉拔器。
2. 调整 Heater 旋钮，直到显示屏显示 12.6。
3. 打开门，手动将 5 μL 毛细管送入上部夹具和加热灯丝，直到管道的一半延伸到灯丝下方（图 1A）。
4. 确认毛细管位于上夹具的"V"形槽中。拧紧上夹具。
5. 在下夹具打开的情况下，手动向上调整垂直滑动，直到下夹具达到其上限。确认管子位于下夹具的"V"形槽中。拧紧下部夹具。
6. 关上门并确认"就绪"指示灯亮起。按下开始按钮以启动加热器和拉动顺序（图 1B）。
7. 确保在热量和重力将毛细管拉开后加热器自动关闭（图 1C），并且滑块向下移动。
8. 开门。握住毛细管顶部，松开顶部夹具。拆下上毛细管并将其放在一边。
9. 将毛细管固定在底部载玻片中，然后松开下部夹具。取下下毛细管并将其放在一边。
10. 使用带有 0.05 μm 氧化铝研磨板的微电极坡口机对拉出的毛细管进行坡口切割，以创建注射针。
11. 吸取足够的水到研磨板上以覆盖表面（图 1D）。
12. 打开坡口，使其开始以 60 rpm 的速度旋转。将拉出的毛细管放入"V"形槽中的移液器夹中。拧紧夹具并将移液器夹具的角度调整至 30°。
13. 调整毛细管尖边的尖端，距离磨板旋转中心约三分之二的距离。
14. 通过调整机械手顶部的粗略控制旋钮来降低夹紧的毛细管。继续降低毛细管，直到毛细管的尖端伸出水面以下并接触磨板的磨料表面。
15. 使用连接到坡口仪的显微镜监测坡口进度。5 分钟后，调整微调控制以将玻璃针从研磨板上抬起。
16. 取下玻璃针并将其置于 10 倍放大倍率下，以检查毛细管的尖端（图 1E，F）。
17. 为确保没有堵塞，将玻璃针头插入注射器上的移液器支架中，然后将空气推入 1 mL 99% 乙醇管中。如果在针尖形成气泡，则针头没有堵塞，可用于显微注射。该工艺还确保了玻璃针的无菌性。
18. 一根毛细管最多可容纳 5 μL 液体。将毛细管标记为 10 个部分，以计算针头上的距离，以标记 0.5 μL 体积。用该距离标记可容纳 0.5 μL 的秤，以备将来准备。对于 5 μL 针头，相距 0.7 mm 的距离相当于 0.5 μL（图 1G）。

2. 小鼠玻璃体内注射

1. 在生物安全 2 级条件下执行本节中的所有程序。
2. 将医用垫放在手术台上，准备手术部位。
3. 打开显微注射器并打开连接到显微注射器的压缩空气罐上的气阀。调整气瓶调节器，直到气体输送量约为 60 psi。
4. 在显微注射器上，按 Mode（模式），直到屏幕显示 Balance（平衡）。按 Balance 并将计算机鼠标放在手术台上。将不锈钢移液器支架连接到连接到进样器"Fill/Output"（进样/输出）的管道上。该管始终连接到注射器。
5. 拧紧针头周围的移液器支架连接器，将毛细管针插入移液器支架的另一端。
6. 打开眼科显微镜并将其光线设置为强度为 50%。在手术台上的手术部位调整显微镜，并将显微镜调整到所需的焦距。
7. 在手术开始之前，通过测试踏板撤退反射确认鼠标已充分麻醉。请务必遵循 IACUC 批准的麻醉方案。
8. 将麻醉的鼠标放在医用垫子上，鼻子指向右侧并靠在左侧。
9. 通过眼科显微镜观察小鼠的右眼，并通过打开眼睛两侧的反向作用镊子的钳子来打开眼睑，以暴露注射部位（图 2C）。
10. 通过左键单击连接到显微注射器的鼠标垫，用蜡样芽孢杆菌 （ATCC 14579） 细菌溶液（200 CFU/μL 稀释液）填充毛细管针（图 2D）。
11. 用左手固定动物的头部，并将针尖放在眼角。将针头置于斜面向上位置并以 45° 角刺穿鼠标眼，但确保在注射时仅插入针头的锋利尖端 （~0.5 mm）。
12. 插入针尖后，将左手从鼠标头移动到鼠标垫上，然后右键单击鼠标垫，注入 0.5 μL 蜡样芽孢杆菌稀释液，溶于脑心浸液 （BHI） 肉汤中。为防止泄漏，请将针尖留在鼠标眼内 2-3 秒，然后再取出（图 2E）。
13. 松开镊子，将鼠标放入位于加热垫上的笼子中。监测这些小鼠，直到它们从麻醉中恢复过来（图 2F）。
14. 一旦小鼠从麻醉中恢复过来，将笼子放回适当的架子上。如果将通过视网膜电图对小鼠进行视网膜功能分析，则应将笼子放回暗室以进行适当的黑暗适应。

结果

图 1:制作斜面玻璃针。 玻璃针由一次性微量毛细管移液器使用针头/移液器拉拔器和微量移液器斜面器制成。（A） 夹在针头/移液器拉拔器中的玻璃毛细管。（B，C）使用所需电压创建玻璃针。（D） 玻璃微量移液器的斜面。（东、女）斜面前后的玻璃微量移液器。（E） 玻璃针的缩放。两个黑点之间的间距为 0.5 μL。

图 2:小鼠玻璃体内注射。

材料