细菌感染定量测定:一种量化细菌性眼内炎小鼠模型中眼内细菌负荷的方法

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 收割管准备

1. 将 1 mm 无菌玻璃珠放入 1.5 mL 螺口盖管中。
2. 在干燥的高压灭菌器中对这些试管进行灭菌。使用前让试管冷却至室温。
3. 将 10 mL 1x 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 添加到无菌 15 mL 离心管中。
4. 将 1 片蛋白酶抑制剂混合物片剂加入试管中。涡旋混合。
5. 将 400 μL 含有蛋白酶抑制剂的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 移液到每个高压灭菌的收获管中。给试管贴上标签并置于冰上。（图 1A）。

2. 收割眼睛

1. 在生物安全 2 级条件下执行本节中的所有程序。
2. 通过吸入 CO₂ 对小鼠实施安乐死。使用辅助方法确认安乐死。
3. 固定安乐死的小鼠头部，并打开受感染眼睛两侧的细尖镊子。向下推向头部以突出眼睛。一旦钳子位于眼球后面，将钳子挤压在一起。将镊子从头部拉开以分离眼球（图 1B）。
4. 立即将眼球放入贴有标签的收获管中。将试管放在冰上不超过 60 分钟（图 1C）。

3. 眼内细菌计数

1. 在生物安全 2 级条件下执行本节中的所有程序。
2. 确认所有收获管都紧密关闭并在组织匀浆器中保持平衡（图 2A）。打开组织匀浆器 1 分钟以匀浆样品。等待 30 秒，然后再打开一分钟。将试管放在冰上（图 2B，C）。
3. 通过将 20 μL 匀浆依次转移到 180 μL 无菌 1x PBS 中，将每个样品连续稀释 10 倍。稀释至达到 ^10-7 的系数（图 2D）。
4. 用适当的稀释因子标记温暖的方形 BHI 板的每一行。将 10 μL 每种稀释液连续转移到倾斜约 45° 的顶部 BHI 板中。让样品运行直到几乎到达板的底部，然后将板平放（图 2E）。
5. 当样品被 BHI 琼脂吸收时，将板转移到 37 °C 培养箱中。将菌落放入培养箱 8 小时后应开始可见。
6. 在蜡样芽孢杆菌菌落的生长干扰识别单个菌落之前，从培养箱中取出板（图 2F）。
7. 为了准确表示样品中的浓度，请对具有 10-100 个菌落的行进行计数。例如，稀释分数为 ^10-4 且有 45 个菌落的行的浓度为 4.5 x 10⁵ CFU/mL。
8. 要计算每只眼睛的细菌总数，请将浓度乘以 0.4，这代表用于均质化眼睛的 1x PBS 的毫升体积。例如，4.5 x 10⁵ CFU/mL 浓度将转化为每只眼睛 1.8 x 10⁵ CFU 蜡样芽孢杆菌。

图 1:收获小鼠感染的眼睛。感染后，在所需的时间点之后，使用无菌镊子收获受感染的小鼠眼睛。（A） 含有无菌玻璃珠的 PBS。（B） 采集受感染的眼睛。（C） 含有小鼠眼睛的收获管。

图 2:处理收获的眼睛进行眼内细菌计数。（A） 收获管，感染的眼睛紧紧夹在组织匀浆器上。（B） 将感染的眼睛匀浆两次，每次 1 分钟。跟踪眼匀浆的稀释 （D） （C） 和随后的铺板 （E） 以进行细菌定量。（E） 轨迹稀释后的代表性个体蜡样芽孢杆菌菌落。