细菌感染定量检测法：一种用于小鼠细菌性眼内炎模型中眼内细菌载量定量的方法

摘要

来源：Mursalin, M. H. 等，细菌性眼内炎小鼠模型中玻璃体内注射及感染参数的定量分析。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频介绍了从由蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）引起细菌性眼内炎的小鼠模型所获取的眼组织匀浆中定量细菌感染的技术。该技术有助于研究宿主免疫反应及其对宿主和眼内细菌基因表达依赖性的机制。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 收集管的准备

1. 将1 mm无菌玻璃珠放入1.5 mL螺口管中。
2. 在干燥模式下，将这些管子放入高压灭菌器中灭菌。使用前让管子冷却至室温。
3. 向无菌的15 mL离心管中加入10 mL 1×无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。
4. 向管中加入1片蛋白酶抑制剂混合片剂，通过涡旋混合。
5. 用移液器将含有蛋白酶抑制剂的400 μL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）加入每个灭菌后的收获管中。标记管子并置于冰上。（图1A）。

2. 收集眼球

1. 本节所有操作均须在生物安全二级条件下进行。
2. 通过吸入 CO₂ 处死小鼠，并采用第二种方法确认动物死亡。
3. 固定已处死小鼠的头部，将精细镊子张开并置于感染眼的两侧，向下朝向头部方向推动以使眼球突出。当镊子尖端到达眼球后方时，夹紧镊子，然后将镊子向外拉离头部以摘除眼球（图 1B）。
4. 立即将摘下的眼球放入标记好的收集管中，并将收集管置于冰上，保存时间不得超过 60 分钟（图 1C）。

3. 眼内细菌计数

1. 本节所有操作均须在生物安全二级条件下进行。
2. 确认所有收集管在组织匀浆器中已紧密封闭并保持平衡（图 2A）。开启组织匀浆器匀浆 1 分钟，暂停 30 秒后，再开启 1 分钟。将管子置于冰上（图 2B,C）。
3. 通过将 20 μL 匀浆液依次转移至 180 μL 无菌 1× PBS 中，对每个样本进行连续 10 倍梯度稀释，直至达到 10^-7 的稀释倍数（图 2D）。
4. 用相应的稀释倍数标记一块预热的方形 BHI 平板的每一行。将每种稀释液各 10 μL 沿倾斜约 45° 的 BHI 平板上端加入，使样品液流至接近平板底部后，再将平板放平（图 2E）。
5. 待样品完全被 BHI 琼脂吸收后，将平板放入 37 °C 培养箱中培养。菌落通常在培养 8 小时后开始可见。
6. 在 B. cereus 菌落生长相互重叠影响单菌落识别之前，及时将平板从培养箱中取出（图 2F）。
7. 为准确反映样本中的浓度，应选择菌落数在 10–100 之间的行进行计数。例如，稀释倍数为 10^-4 的行中若含有 45 个菌落，则其浓度为 4.5 × 10⁵ CFU/mL。
8. 为计算每只眼中的细菌总数，将上述浓度乘以 0.4，该数值代表用于匀浆眼球的 1× PBS 体积（毫升）。例如，4.5 × 10⁵ CFU/mL 的浓度相当于每只眼含有 1.8 × 10⁵ CFU 的 B. cereus。

结果

图 1： 小鼠感染眼的采集。 感染后，在预定时间点，使用无菌镊子采集感染的小鼠眼球。(A) 含无菌玻璃珠的 PBS。(B) 感染眼的采集过程。(C) 含小鼠眼球的采集管。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-20 µL 移液器   	RANIN	L0696003G	NA
37°C 培养箱 	Fisher Scientific	 11-690-625D	NA
脑心浸液培养基（Bacto Brain Heart Infusion）  	BD	90003-032	NA
细胞显微注射仪  	MicroData Instrument, Inc.	PM2000	NA
细尖镊子 Thermo 	Fisher Scientific	 12-000-122	NA
玻璃珠 1.0 mm  	BioSpec	11079110	NA
摇床培养箱  	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
5 微升玻璃毛细移液管  	Kimble	71900-5	NA
微移液管磨边仪 	 Sutter Instrument Co.	BV-10	NA
显微镜 Axiostar Plus 	Zeiss		NA
显微镜 OPMI Lumera 	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16 高通量组织研磨仪 	BioSpec	 Model 607	NA
针头/移液管拉制仪  	Kopf	730	NA
PBS   	GIBCO	1897315	分子生物学级
蛋白酶抑制剂混合物 	 Roche	4693159001	分子生物学级
反向操作镊子 	 Katena 	K5-8228	NA