离体肺灌注：一种用于兔模型肺部研究的技术

摘要

来源：Pacheco-Baltazar, A.，等，兔模型中的离体肺灌注系统。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了一种用于离体肺灌注的离体技术。该技术是肺部研究的工具，有助于研究肺移植过程中涉及的各种生理和病理机制。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 插管：

1. 将新鲜分离的兔肺连同心脏置于培养皿中的无菌纱布上。
2. 为防止肺不张，采用正压通气方式对肺进行通气，呼气末正压（PEEP）设定为 2 cmH₂O。
3. 在房室沟水平处剪除心室，将其从心脏上移除。
4. 打开两个心室后，将外径为 4.6 mm 带篮状结构的兔肺动脉插管经肺动脉插入，同时将外径为 5.9 mm 带篮状结构的兔左心房插管经二尖瓣插入左心房。
5. 使用 4-0 丝线分别在肺动脉和左心房处固定插管。结扎时应包含肺动脉和左心房周围的组织，以避免这些结构扩张。
6. 通过动脉插管注入 250 mL 生理盐水溶液，以冲洗血管床中残留的血液。

2. 灌注技术：

1. 实验设置：
   1. 将分离的肺组织小心放入肺腔室中。
   2. 将气管连接至腔室盖上的换能器。
   3. 将插管的血管连接至灌注系统。
   4. 关闭腔室，并用旋转锁固定。
      注意：循环灌注回路包括一个开放的静脉储液器、一个蠕动泵、一个热交换器和一个气泡捕获装置。
   5. 此时，安装腔室盖，并切换三通阀，使通气模式由正压切换为负压。为检查肺的负压通气效果及腔室的密封性，需观察肺的呼吸运动幅度以及压力计上的腔室压力。
   6. 用 200 mL 无血人工灌注液（含 2.5% 牛血清白蛋白的 Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液）灌注肺组织。
   7. 初始灌注流速设为 3 mL/min/kg，随后在 5 分钟内逐步增加至 5 mL/min/kg；再在接下来的 5 分钟内增至 8 mL/min/kg；最后在另一个 5 分钟内达到最大流速 10 mL/min/kg。注意避免空气进入灌注回路。
      注意：维持灌注液的 pH 和温度在生理范围内（pH 7.4–7.5；温度 37 °C–38 °C）。调节 pH 时，可加入 NaHCO₃ (1N) 或增加二氧化碳流量；也可使用 HCl (0.1N) 进行酸化。
2. 参数设置：
   1. 检查预设的灌注与通气参数是否已按要求设定。
   2. 以湿度饱和的空气对肺进行通气，通气频率为 30 次/分钟，潮气量为 10 mL/kg，呼气末正压（Pe）为 2 cmH₂O。
      注意：肺动脉压（0–20 mmHg）对应于氧合器或储液器中液面高于肺动脉主干的厘米数，而肺静脉压则对应于压力平衡室高于左心房的高度。这两个数值均可调节。注意左心房压力也为 0–20 mmHg。
3. 实现第 3 区（zone 3）条件：
   1. 利用固定在肺动脉、左心房和压力换能器上的导管，通过导管侧端口连接，测量动脉压（Pa）和静脉压（Pv）。
   2. 将基准压力设为肺门水平（零参考点）。
   3. 在第 3 区通气条件下进行实验。为此，等待 10–15 分钟，直至达到等重状态的平衡。
   4. 确保静脉压高于肺泡压（Palv），且动脉压高于两者（Pa > Pv > Palv），以实现第 3 区条件。
   5. 确保肺重量保持恒定，动脉压和左心房压力稳定，以实现第 3 区条件，从而最大程度开放肺血管并维持实验期间微血管床的内容物。 
      注意：以 Kfc 作为肺水肿指标的测量结果，在手动与自动灌注系统之间无差异。
4. 电子控制与信号处理：确保呼吸流量、重量变化、微血管压力、潮气量、血管阻力等信号由多通道中央电子单元采集，该单元整合来自换能器的信号，并在评估系统中实时显示。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双止位Tygon E-Lab管，内径3.17 mm，每包12根，黑白双色	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1864
IPL-4正压通气适配器	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
IPL-4正压通气适配器	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
IPL-4负压通气期间向气管供应不同于室空气体混合物的替代无压供气装置	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4309
兔至胎猪离体灌注肺基座单元	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4138
牛血清A2:D41白蛋白冻干粉	sigma	3912	500 g
氯化钙，CaCl2·2H2O	JT Baker	10035-04-8
冻存管	Corning	430659	2 mL
D-葡萄糖，C6H12O6	sigma	G5767
差分低压换能器DLP2.5，量程±2.5 cmH2O，HSE连接器	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-3882
差分压力换能器MPX，量程±100 cmH2O，HSE连接器	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0064
Eppendorf管
色谱纯无水乙醇	Caledon
Falcon管			14 mL
哈佛蠕动泵P-230（含控制箱和P-230电机驱动器）	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	70-7001
加热式线性气流传感器，流量范围0至10 L/min	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9349
单气流传感器加热控制器，230 VAC，50 Hz	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9703
肝素	PISA		5000 UI
高效液相色谱柱（C18 100A 5U）	Alltech	98121213	150 mm x 4.6 mm
亲水性注射器滤器	Millex	SLLGR04NL	4 mm
IPL-4离体兔至胎猪肺核心系统，230	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
IPL-4离体兔至胎猪肺核心系统，230 V	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
带砂芯和管路的夹套玻璃缓冲液储液瓶，6.0 L	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0322
劳达恒温循环器，型号E-103，230 V/50 Hz，浴槽容积3 L，温度范围20至150°C	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0125
带篮式结构的兔左心房插管，外径5.9 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4162
PLUGSYS模块用低量程血压换能器P75	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0020
七水合硫酸镁，MgSO4·7H2O	JT Baker	10034-99-8
微量离心管	Corning	430909
IPL-4负压通气控制选件，含压力调节器	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4298
新西兰兔
PISABENTAL（戊巴比妥钠）	PISA	Q-7833-215
PLUGSYS机箱，型号603*7	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0045
PLUGSYS TCM时间计数模块	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1750
PLUGSYS换能器放大模块（TAM-A）	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0065
PLUGSYS换能器放大模块（TAM-D）	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1793
PLUGSYS VCM-4R通气控制模块，含压力调节器	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1755
氯化钾，KCl	JT Baker	3040-01
磷酸二氢钾，KH2PO4	JT Baker	7778-77-0
带篮式结构的兔肺动脉插管，外径4.6 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4161
灌注伺服控制器（SCP）	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-2806
带卡扣盖的微量离心管	Costar	3620	1.7 mL
碳酸氢钠，NaHCO3	sigma	S6014
氯化钠，NaCl	sigma	S9888
7.5号外科手套
8号外科手套
Taygon管	Masterflex
兔气管插管，外径5.0 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4163