准备用于实验干预的清醒兔模型同步视频-脑电图-心电图-血氧饱和度-二氧化碳图：兔模型中植入脑电图/心电图电极及连接呼吸监测探头的操作流程

摘要

来源：Bosinski, C. 等，清醒束缚兔模型中癫痫发作、心律失常和呼吸暂停的多系统监测，J. Vis. Exp. (2021)。

本视频演示了在兔模型中植入脑电-心电电极并连接呼吸探头的操作步骤，以采集和分析其生物信号记录。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 植入脑电图-心电图电极并连接呼吸监测器

1. 从运输箱中取出一只兔子，放在坐着的研究人员腿上。
2. 将兔子垂直抱持，并使其靠近操作者身体。
3. 将兔子置于仰卧位'将兔子的头部置于研究者的膝盖处，且使其头部低于身体其他部位。
   注意： 该操作可使动物放松，并最大限度地降低其在放置电极过程中试图移动或逃脱的可能性。
4. 现在，将兔子固定于仰卧位后，让第二位研究人员拨开毛发，直至能够识别并分离出皮肤与下方组织。
5. 插入 35˚ 每个腋下皮下植入弯曲电极（图1A).
   注意： 电极应穿过皮肤并牢固地钩住，但不得深入穿透其他结构。让电极从皮肤进入后再穿出（贯穿式）可降低在将兔子放入固定装置时或实验过程中因动物移动而导致导联脱落的风险。图1B所有电极在放置前均需用70%乙醇灭菌。
6. 将电极导联置于胸部，位于右前肢和左前肢的后方，以及腹部左侧后肢的前方。将接地针式电极置于腹部，位于右后肢的前方。图2A).
7. 将所有心电图导联正确放置后，将兔子恢复至俯卧位，导线沿兔子腹部一侧向上引出，并将兔子转移至合适尺寸的固定装置中（例如 6" x 18" x 6"）。将兔子放入固定装置时，应将松动的导线向上拉紧，以尽量防止兔子用腿部将电极拉出。用胶带将导线固定在固定装置的侧边，避免在实验过程中导线被兔子压在身下。图2B).
8. 将兔放入固定器中，下压颈部固定装置并锁定。同时，将后肢向上移至动物腹部下方，并固定后部约束装置。
   注意： 应确保颈圈下方的空间可容纳1-2根手指，以确认其松紧适度，不过紧。特别是在可能存在运动活动的实验过程中，务必收紧固定装置，以尽量减少动物活动，防止潜在的脊柱损伤、肢体脱位以及后肢挣脱固定装置的情况发生。图2B兔子被固定在束缚器中约5小时，未出现与活动增加或脱水迹象相关的问题。
   1. 对于体型较小的兔子（例如，小于2个月大），在动物身下放置一个橡胶增高垫以抬高兔子，防止其颈部接触头部固定装置的底部图 2C).
      注意： 呼吸频率和心率突然下降可能是颈部受压所致。若发生此情况，应松开颈部固定装置并抬起兔子'头部抬起以缓解颈部受压。
   2. 当后部固定装置未能紧密贴合兔子的背部/脊柱时，应放置一个PVC间隔垫以防止可能造成脊柱损伤的任何移动。
      注意： 例如，可使用长约14 cm、内径4英寸的PVC管，将其下部25-33%切除，并在管内加装泡沫材料，套于兔体上以实现适当的固定图 2C).
9. 现在，将兔子安全地放入固定器后，将7-13 mm的皮下直针电极插入头皮图1A）。使用45˚ 进入角度应倾斜，将导线从耳间向上引出，并松散地将导线固定在头部后方的固定装置上，以维持导联位置。放置5个脑电图（EEG）导联，位置如下：右前侧、左前侧、右枕部、左枕部，以及位于其余4个导联之间的中央参考导联（Cz）。图2D).
   注意： 当电极被正确放置于颅骨外的皮下组织时，即为适当的位置。这种放置方式可最大限度地减少来自鼻部、耳部及其他周围肌肉的伪迹。由鼻部节律性运动产生的部分伪迹难以避免。前部脑电图导联应置于兔耳内侧'眼睛向前看。枕部导联应置于耳前，并朝向内侧方向。Cz 导联放置于头顶中心，位于全部 4 个电极之间的中点位置（沿缝合线，Lambda 与 Bregma 的中点）。Cz 电极的针脚朝向前方。
   1. 将脑电图导线从兔子双耳之间向上穿过，以避免兔子咬到导线。
10. 将脉搏血氧仪的脉搏波描记器连接至兔子耳缘耳静脉处的耳部。
    注意： 可能需要剃除耳部多余的毛发以增强信号，或使用纱布固定传感器。
    1. 确保容积描记法显示的心率与心电图（ECG）测得的心率一致，并显示血氧饱和度（图3C).
11. 轻轻将带有二氧化碳监测管的面罩覆盖在兔子的口鼻上（图 2H用绳子将面罩固定，并将绳子两端系在固定装置上。将二氧化碳监测管的另一端连接到生命体征监护仪。
    注意： 实验过程中应防止绳索覆盖兔子的眼睛。为此，将绳索用胶带固定在兔耳之间束缚器的中部。为了改善二氧化碳监测信号，可使用胶带和一小片腈纶材料制作单向阀，使氧气能够进入T型管，同时将呼出的CO2导入二氧化碳监测管路图 2I).

2. 视频脑电图-心电图的记录

1. 使用市售的脑电图软件进行视频-脑电图-心电图（video-EEG-ECG）记录。
   注意：生物电位导联与视频信号需时间同步，以便后续将电生理信号与视频信号进行关联分析（例如，脑电图尖波与肌阵挛性抽动的对应关系）。
2. 确认连接状态良好，无基线漂移、无60 Hz电噪声干扰，并具有高信噪比。具体而言，应确保心电图上可清晰识别心电波形的各个时相，且脑电图上的δ波、θ波和α波未被高频噪声明显遮蔽。
   1. 若所有电极均产生过多噪声，应调整中央参考电极；若仅单个电极噪声过大，则将该电极更深入地压入皮肤或重新定位，直至无金属部分暴露在外。
3. 调整视频画面，确保可同时观察到所有兔只，以便将运动活动与脑电图发现进行关联（图3A）。
   注意：该系统最多可同时对7只兔进行脑电图/心电图/血氧饱和度/二氧化碳监测的同步记录。
4. 对每只动物至少进行10–20分钟的基础状态记录，或持续记录至心率稳定于安静放松状态（200–250次/分钟），且兔只连续5分钟内无明显大动作。采集全频带电生理数据时不使用任何滤波器。为更清晰地显示数据，可将低频滤波器（即高通滤波器）设置为1 Hz，高频滤波器（即低通滤波器）设置为59 Hz。
   注意：兔只处于放松状态的另一表现是脑电图中出现睡眠纺锤波（后文将详细讨论）。
5. 在实验过程中实时添加时间同步注释，以标记干预措施（如给药）和神经-心脏事件（如脑电图尖波、运动性癫痫发作、异位搏动及心律失常）以及运动干扰或研究者引起的伪迹。
   注意：由于研究者需频繁实施干预（如光刺激、给药），为尽量减少进出房间及开关门所造成的动物应激，研究者在整个实验过程中应始终停留在房间的对侧。研究者应尽可能远离动物，并保持静止与安静，以最大限度避免对动物造成干扰。

结果

图1：脑电图（EEG）和心电图（ECG）电极示意图。 （A）弯曲的心电图电极和直的脑电图电极。（B）如何将心电图电极钩入兔皮下组织，使其贯穿固定。缩写：LL：左下肢，RA：右上肢，RL：右下肢，LA：左上肢，RF：右额部，LF：左额部，Cz：中央，RO：右枕部，LO：左枕部。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
计算机	Dell	Optiplex 5040	数据采集计算机
心电图电极	RhythmLink	RLSND116-2.5	13 mm 35度弯曲（0.4 mm 直径）皮下针状电极
脑电图电极	RhythmLink	RLSP513	5股绞合 13 mm 直型（0.4 mm 直径）皮下针状电极
EEGLAB (2020)	Swartz 计算神经科学中心	开放获取	可进行脑电图谱分析
以太网转以太网适配器	Linksys	USB3G16	用于连接相机与计算机的适配器
泡沫垫	通用	N/A	减轻固定装置对小型兔颈部施加的压力，以防止颈部受压引起的不良心肺效应
MATLAB (R2019b, Update 5)	MathWorks	N/A	运行 EEGLAB 所必需
麦克风	Sony Stereo	ECM-D570P	记录癫痫发作时可听见的表现
美纹医用胶带，纸质，白色	3M	1530-1	用于固定导线并制作耳部夹板
Natus NeuroWorks	Natus	LC101-8	数据采集与回放软件
光刺激器	Grass	PS22	可调节光脉冲频率、延迟、持续时间和强度的刺激器
塑料线缆整理器/捆扎器	12Vwire.com	LM-12-100-BLK	捆扎导线以减少噪声干扰
PS 22 光刺激器	Grass Instruments	BZA641035	闪光频率、延迟和强度可调的闪光灯
聚氯乙烯管	通用	N/A	防止小型兔后肢踢蹬造成脊柱损伤
兔固定装置	Plas-Labs	501-TC	提供多种尺寸的兔固定装置。本研究中使用尺寸为 6" x 18" x 6"。
橡胶垫（增高层）	通用	N/A	抬高小型兔在固定装置中的位置，以防止颈部受压
SpO<sub>2</sub> 耳夹	NONIN	61000	PureSAT/SpO2
SpO<sub>2</sub> 传感器适配器	NONIN	13931	XPOD PureSAT/SpO2
Webcol 酒精消毒片，无菌，大号，双层	Covidien	5110	导管插入前准备耳静脉
LabChart Pro (2019, 版本 8.1.16)	ADInstruments	N/A	心电图分析
Quantum 放大器	Natus	13926	放大器/数字化仪
Quantum 头盒放大器	Natus	22134	64针接线分线盒
SRG-X120 1080p PTZ 摄像机，带 HDMI、IP &amp; 3G-SDI 输出	Sony	SRG-X120	Impela 摄像机