分离IPE和RPE细胞：一种从兔眼获取眼色素上皮细胞的技术

摘要

来源：Bascuas, T.，等。用于非病毒基因治疗的哺乳动物原代色素上皮细胞的分离、培养与基因工程。 J. Vis. Exp. (2021)。

在本视频中，我们展示了一种从兔模型中获取眼色素上皮细胞的方法。这些细胞有助于开发针对视网膜变性疾病的治疗策略。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会的审核。

通过腹腔注射0.9% NaCl稀释的戊巴比妥钠（150 mg/kg）过量麻醉处死新西兰白兔，并在处死后立即摘除眼球。

1. 准备前

1. 配制完全培养基（DMEM/Ham's F12，添加10%胎牛血清（FBS）、80 U/mL青霉素/80 µg/mL链霉素和2.5 µg/mL两性霉素B）。将培养基、1× PBS和0.25%胰蛋白酶（如需要）置于37 °C水浴中预热。
2. 在超净台内铺放无菌铺巾，以准备无菌操作区域。将所有需要的无菌器械和材料放入超净台内。
   注意：仅眼球去核以及清除残留的肌肉组织和皮肤可在超净台外进行，其余所有步骤必须在超净台内完成。

2. 兔PE细胞的分离

1. 使用弯头剪刀和Colibri镊子在处死动物后摘除眼球。用剪刀和镊子（非无菌）清除眼球上残留的肌肉组织和皮肤。
   注意： 用于眼球摘除和清理的剪刀和镊子的尺寸取决于物种（例如，大鼠和小鼠所用器械将小于猪和牛所用器械）（参见 图1).
   1. 将眼球收集到装有非无菌 PBS 的 50 mL 管中，并将管子转移至超净工作台。将眼球浸入含碘溶液中消毒 2 分钟，然后转移至盛有无菌 PBS 的培养皿中。
2. 灯泡的开启
   1. 将一只眼球置于无菌纱布上，紧贴视神经并固定。使用11号手术刀和剪刀在角膜缘下方约2毫米处切开眼球。移除前段结构（角膜、晶状体和虹膜），并将其放入培养皿中。保留含有玻璃体的眼杯，直至完成视网膜色素上皮细胞的分离。
3. IPE细胞的分离
   1. 移除晶状体，并用精细镊子小心地取出含有虹膜色素上皮（IPE）细胞的虹膜。将虹膜置于培养皿中，用无菌 PBS 洗涤并浸泡于 PBS 中，直至其他虹膜组织处理完毕。使用 #10 手术刀片切除虹膜上的睫状体。
   2. 在制备2个虹膜后，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育10分钟；在此期间可分离视网膜色素上皮（RPE）细胞（见步骤2.4）。去除胰蛋白酶，向虹膜中加入1 mL完全培养基，用经火焰抛光的扁平巴斯德吸管轻轻刮擦以分离细胞。通过吹打小心重悬细胞，并将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。取10 µL细胞悬液，用台盼蓝按1:3比例稀释，用于在血细胞计数板（Neubauer计数室）中进行细胞计数。
   3. 若不能立即转染，则在24孔板中每孔接种200,000个细胞（100,000个细胞/cm²）²) 加入1 mL完全培养基（10% FBS）中（接种方法见 表1将培养板放入培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下培养。
      注意： 可能需要合并多个眼睛的细胞以获得足够的细胞用于接种。
4. 视网膜色素上皮细胞的分离
   1. 用细镊子从眼后段去除玻璃体和视网膜。注意避免损伤视网膜色素上皮。
   2. 将无菌纱布放入12孔板中，并将球囊置于纱布上方。
   3. 用 PBS 洗涤。每只眼球加入 50 µL 0.25% 胰蛋白酶，于 37 °C 孵育 10 分钟。去除胰蛋白酶，每只眼球加入 150 µL 完全培养基，用弯曲的火焰抛光巴斯德吸管轻轻刮取视网膜色素上皮（RPE）细胞；使用精细镊子固定组织。收集细胞悬液，置于 1.5 mL 离心管中。取 10 µL 细胞悬液，用台盼蓝按 1:4 比例稀释，于纽鲍尔计数板中进行细胞计数。
   4. 离心细胞10分钟，120 × g g.
   5. 若不能立即转染，则在24孔板中每孔接种200,000个细胞（100,000个细胞/cm²）²) 加入1 mL完全培养基（10% FBS）中（接种方法见 表1将培养板放入培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下培养。
      注意： 可能需要合并多个眼睛的细胞以获得足够的细胞数量用于接种。

结果

物种	胰蛋白酶处理	N° IPE 细胞	N° RPE 细胞	用于接种的培养板（100,000 个细胞/cm²）2)
兔子	是	~350,000	~2,500,000	24孔板

表1：从兔眼分离的原代PE细胞数量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12孔板	Corning	353043
24孔板	Corning	353047
聚维酮碘	Mundipharma
博恩显微镊，平头
科利布里斯镊（无菌）
DMEM/Ham's F12	Sigma-Aldrich	D8062
手术巾（无菌）	Mölnlycke Health Care	800530
FBS	Brunschwig	P40-37500
镊子（不同尺寸）（无菌）
纱布敷料	PROMEDICAL AG	25403
NaCl (0.9%)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
血细胞计数板（纽鲍尔计数室）	Marienfeld-superior	640010
巴斯德吸管（火焰抛光）	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
青霉素/链霉素	Sigma-Aldrich	P0781-100
戊巴比妥（硫喷妥钠 Inresa）	Ospedalia AG	31408025
培养皿	ThermoFisher Scientific	150288
10号手术刀片	Swann-Morton	501
11号手术刀片	Swann-Morton	503
尖-尖头弯型超细博恩剪刀（无菌） 
尖-尖头直型超细博恩剪刀（无菌）
胰蛋白酶 0.25% 	ThermoFisher Scientific	25050014
瓦纳斯弹簧剪刀，弯型（无菌）