分离IPE和RPE细胞：一种从离体猪眼中获取色素上皮细胞的技术

本文内容

摘要

在本视频中，我们介绍了一种从猪眼分离虹膜和视网膜色素上皮细胞的技术，以获得这些细胞的原代培养物，用于体内和离体研究。这些色素细胞可进行基因改造，以研究治疗眼部疾病所需的再生医学方法。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 准备前

配制完全培养基（DMEM/Ham's F12，添加10%胎牛血清（FBS）、80 U/mL青霉素/80 µg/mL链霉素和2.5 µg/mL两性霉素B）。将培养基、1× PBS和0.25%胰蛋白酶（如需要）置于37 °C水浴中预热。
在超净工作台内铺无菌巾，以准备无菌操作区域。将所有需要的无菌器械和材料放入超净工作台内。
注意：仅眼球摘除及去除残留的肌肉组织和皮肤可在超净工作台外进行，其余所有步骤必须在超净工作台内完成。
猪眼球于屠宰后6小时内从当地屠宰场获取，并置于冰上运送到实验室

2. 猪PE细胞的分离

动物处死后，使用弯头剪刀和科尔伯里镊子摘除眼球。用剪刀和镊子（非无菌）清除眼球上残留的肌肉组织和皮肤。
注意：用于眼球摘除和清洁的剪刀和镊子的尺寸取决于物种（例如，大鼠和小鼠所用器械比猪和牛所用的更小）（见图1）。
1. 将摘除的眼球收集至装有非无菌 PBS 的 50 mL 离心管中，并将离心管转移至超净工作台。将眼球浸入含碘消毒液中消毒 2 分钟，随后转移至盛有无菌 PBS 的培养皿中。
2. 将眼球转移至无菌培养皿后，用科尔伯里镊子或尖头镊子牢固夹住视神经附近部位。在虹膜边缘附近（睫状体平坦部与锯齿缘之间）用 18 G 针头刺一小孔。将小剪刀插入孔中，沿虹膜周围剪开。移除前段结构（角膜、晶状体和虹膜），并将其置于培养皿中。保留含有玻璃体的眼杯，直至完成视网膜色素上皮细胞的分离。

3. IPE 细胞的分离

使用10号手术刀将睫状体从虹膜上切除。制备2个虹膜后，加入1 mL完全培养基，用经过火焰抛光的扁平巴斯德吸管轻轻刮取，以分离细胞。将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。取10 µL细胞悬液，用台盼蓝按1:4比例稀释，用于在血细胞计数板（Neubauer计数室）中进行细胞计数。
若不立即进行转染，则将200,000个细胞/孔接种于24孔板中（100,000个细胞/cm²），每孔加入1 mL完全培养基（含10% FBS）（接种密度参见表1）。将培养板置于培养箱中，在37 °C、5% CO₂条件下进行培养。
注意：为获得足够的接种细胞数，可能需要合并多个眼球的组织样本。

4. 视网膜色素上皮细胞的分离

执行步骤 1.1.1。将眼球置于培养皿中，用 PBS 洗涤。向眼球内加入 1 mL 完全培养基。
使用弯曲的火焰抛光巴斯德吸管，小心地去除视网膜色素上皮（RPE）细胞。务必从底部向上刮取，以避免脉络膜-Bruch 膜复合体滑脱。用 1,000 µL 移液器收集眼球内的细胞悬液，并转移至 1.5 mL 离心管中重悬。取 10 µL 细胞悬液，用台盼蓝按 1:8 比例稀释，用于在血细胞计数板（Neubauer 室）中计数细胞。
按照步骤 3.2 所述方法接种细胞。

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材料

物种	胰蛋白酶处理	N° IPE 细胞	N° RPE 细胞	用于接种的培养板（100,000 个细胞/cm²）²)
猪	无	~1,000,000	~3,000,000	24孔板

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