角巩膜纽扣状组织分离：一种从猪眼获取角巩膜纽扣状组织的手术操作方法

摘要

来源：Okurowska, K.，等。建立猪离体角膜模型用于研究针对细菌性角膜炎的药物治疗。J. Vis. Exp. (2020)。

在本视频中，我们展示了一种手术分离角巩膜纽扣组织以构建离体猪角膜模型的方法。由于该模型与人眼具有相似性，因此在组织学、病理学和药理学研究中具有重要应用价值。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 灭菌

1. 关键步骤：将所有镊子和剪刀浸入含5%（v/v）Distel的蒸馏水溶液中消毒1小时，用刷子刷洗，再用自来水冲洗，最后于185 °C烘箱中灭菌至少2小时。
2. 将所有其他玻璃器皿和试剂在121 °C下高压灭菌15分钟，或按照制造商说明配制试剂。后续操作均须在II级微生物安全柜中进行。

2. 样本采集

1. 猪眼的采集
   1. 使用大型白色长白母猪，与汉普夏公猪杂交。动物经电击晕后，在屠宰场于2小时后摘除眼球。
   2. 关键步骤：眼球摘除后，应立即将其转移至无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中运送至实验室，以防止干燥，并在到达后立即进行处理。

3. 角巩膜瓣的制备

1. 使用无菌镊子夹住眼球周围的组织，并将其转移至培养皿中。在培养皿中使用15号手术刀片和镊子去除眼球周围的结膜和肌肉组织。
2. 用镊子夹住视神经，轻轻抬起眼球，并转移至一个装有无菌PBS的0.5 L广口瓶中。
3. 待所有眼球的周围组织清除完毕后，用无菌镊子将其转移至另一个装有含3% (v/v) 聚维酮碘的PBS溶液的0.5 L广口瓶中，浸泡1分钟。
4. 将眼球转移至另一个装有无菌PBS的0.5 L广口瓶中。
5. 在培养皿中用镊子固定眼球，并使用10A号手术刀片在角膜附近做一切口。
6. 关键步骤：夹住切口边缘，使用剪刀切除角膜，保留角膜周围约3 mm的巩膜。确保剪刀尖端不刺穿虹膜或脉络膜组织，操作应位于脉络膜上腔。
7. 用镊子夹住角巩膜瓣，使用另一对尖头镊子轻轻分离葡萄膜组织。
8. 从剩余的眼球上提起角巩膜瓣，并在12孔板中用含1.5% (v/v) 聚维酮碘的PBS溶液短暂冲洗。
9. 将角巩膜瓣放入另一个装有无菌PBS的12孔板中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Cellstar 12 孔板	Greiner Bio-One	665180
Distel	Fisher Scientific	12899357
镊子	Fisher Scientific	15307805
PBS	SLS	P4417
培养皿	Fisher Scientific	12664785
聚维酮碘	Weldricks 药房	2122828
15 号手术刀片	Fisher Scientific	O305
Swann Morton 手术刀	Fisher Scientific	11849002