猪角膜离体细菌性角膜炎模型：一种在角膜上皮细胞中建立细菌感染的技术

摘要

来源：Okurowska, K.，等。建立猪离体角膜模型用于研究针对细菌性角膜炎的药物治疗。J. Vis. Exp (2020)。

本视频介绍了一种利用猪眼球角巩膜环组织建立细菌性角膜炎离体模型的实验方案。接种的细菌可通过角膜上皮切口侵入下方基质层，并在角膜组织内建立感染，从而模拟体内感染过程。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会以及 JoVE 兽医审查委员会的审核

1. 接种物的制备

1. 将 10 mL LB 肉汤倒入带有泡沫塞的 50 mL 锥形瓶中。
2. 从新鲜的琼脂平板上挑取一环 P. aeruginosa PAO1 菌株或 PA14 菌株，于 37 °C 培养 3–4 小时，直至细菌进入对数生长中期。
3. 将细菌培养物转移至 50 mL 离心管中，在 3,000 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，并用 PBS 重悬菌体沉淀。
4. 重复步骤 1.3 两次以洗涤细胞。用 PBS 重悬菌体沉淀，并以无菌 PBS 作为空白对照，将 600 nm 处的光密度值调整至约 0.6。

2. 感染角巩膜瓣

1. 从培养皿中移除培养基，并用 1 mL 无菌 PBS 冲洗角膜两次。
2. 用镊子轻轻夹住角膜，同时使用 10A 手术刀在角膜巩膜瓣的中央区域进行四道切割——两道垂直，两道水平——切口需穿过上皮层到达下方的基质层。
3. 将无菌玻璃模具宽面朝上置于 6 孔板中，并将角膜放置于玻璃模具中央，上皮面朝下。切割位置应正对玻璃模具底部中央。
4. 关键步骤：加入 1 mL 含 1% (w/v) 低熔点琼脂的 DMEM 溶液，完全填充带有角膜的玻璃模具。
5. 待琼脂凝固后，将玻璃模具翻转，使角膜上皮面朝上。
6. 用移液器将 15 μL 细菌培养物（OD_600nm = 0.6；对于 P. aeruginosa ，相当于 15 μL 中约含 1 × 10⁷ 个菌落形成单位（CFU））直接加入切口区域，然后在上方加入 85 μL PBS，以保持角膜上皮湿润。 将剩余的细菌培养物进行梯度稀释，并涂布于琼脂平板上，用于计数接种物的菌落形成单位。
7. 在每个含有玻璃模具的孔底部加入 1 mL 不含抗生素的 DMEM。将接种后的角膜巩膜瓣置于 37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中培养，最长培养时间为 24 小时。
8. 每次实验均需设置未感染的对照角膜。制备未感染对照时，在步骤 2.6 中用 15 μL 无菌 PBS 替代细菌培养物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 mL Falcon管	SLS	352070
两性霉素B	Sigma	A2942
Cellstar 12 孔板	Greiner Bio-One	665180
葡聚糖	Sigma	31425-100mg-F
迪斯特尔	Fisher Scientific	12899357
DMEM + glutamax	SLS	D0819
双温培养箱	SLS	OVe1020	灭菌烘箱
表皮生长因子	SLS	E5036-200UG
F12 HAM	Sigma	N4888
胎牛血清	Labtech International	CA-115/500
镊子	Fisher Scientific	15307805
Heracell VIOS 160i	赛默飞世尔科技	15373212	组织培养箱
胰岛素，重组人源	SLS	91077C-1G
LB 琼脂	Sigma	L2897
Multitron	Infors	不适用	细菌培养箱
PBS	SLS	P4417
青霉素-链霉素	SLS	P0781
培养皿	Fisher Scientific	12664785
35x10 mm 细胞培养皿（CytoOne）	Starlab	CC7672-3340
聚维酮碘	韦尔德里克斯药房	2122828
安全 2020	Fisher Scientific	1284804	II级微生物安全柜
15号手术刀片	Fisher Scientific	O305
手术刀 Swann Morton	Fisher Scientific	11849002