离体猪肺生物膜模型：一种用于研究猪细支气管组织上细菌生物膜的肺部模型构建技术

摘要

来源：Harrington, N.E. 等，囊性纤维化肺部铜绿假单胞菌与金黄色葡萄球菌生物膜的离体抗生素疗效测试。J. Vis. Exp. (2021)。 

本视频介绍了在感染的细支气管组织上建立猪离体肺细菌生物膜模型的实验方案。生物膜是嵌入于基质中并附着于表面的细菌聚集体。该模型用于研究细菌在不同生物膜形成阶段对抗生素的敏感性。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 离体猪肺（EVPL）组织的解剖与感染

1. 制备用于EVPL组织的SCFM，按照表1中提供的1 L改良SCFM配方进行配制。
2. 在解剖前，使用实验室中常规用于P. aeruginosa/S. aureus的琼脂（例如，LB琼脂+1.2%琼脂），制备所需细菌菌株的琼脂平板用于感染。
3. 计算实验所需的猪支气管组织块数量，包括未感染的对照组织块。将此数量乘以2，以便在两个重复肺组织中重复实验，以确认结果的可重复性。
4. 将所需组织块总数乘以0.5，以确定所需SCFM琼脂糖（mL）的体积，用于制备琼脂糖垫，确保每块组织有400 μL培养基，并额外预留SCFM琼脂糖以补偿移液误差或制备过程中的蒸发损失。
5. 每15 mL所需SCFM中加入0.12 g琼脂糖，以配制含0.8%（重量/体积）琼脂糖的所需总体积SCFM。
6. 加热SCFM琼脂糖溶液直至琼脂糖完全溶解。建议使用低功率家用微波炉加热，具体时间取决于微波炉功率。待琼脂糖冷却至约50 °C（手感温热但可安全持握），切勿进一步冷却。
7. 使用移液器，为每个所需组织块向24孔板的每孔中加入400 μL SCFM琼脂糖。
8. 将含SCFM琼....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰岛素注射器 - 0.5 mL，带29G针头	VWR	BDAM324892
24孔培养板
用于解剖器械表面消毒和灼烧灭菌的70%乙醇或类似物
用于制备铜绿假单胞菌/金黄色葡萄球菌划线的琼脂平板（任何合适的培养基）
琼脂糖
铝箔——经高压灭菌预消毒——用于覆盖解剖肺组织时所用的砧板。
用于多孔板的Breathe-easy或Breathe-easier密封膜	Diversified Biotech	BEM-1 或 BERM-2000
本生灯
砧板——我们推荐使用塑料砧板，以便用酒精轻松去污。
用于运输肺组织至实验室的冷藏箱
不同尺寸的解剖剪
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）
大型刮刀
安装好的剃须刀片
培养皿
塑料砧板和铝箔，用于创建无菌且可清洁的解剖操作表面
Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基
SCFM			如表1所列的试剂
镊子的选择（建议使用钝头镊子）
根据贵机构规定，用于处置受污染的锐器和猪肺组织的合适容器<支气管/> 健康 &以及安全政策。