离体猪肺生物膜模型：一种用于研究猪细支气管组织上细菌生物膜的肺部模型构建技术

摘要

来源：Harrington, N.E. 等，囊性纤维化肺部铜绿假单胞菌与金黄色葡萄球菌生物膜的离体抗生素疗效测试。J. Vis. Exp. (2021)。 

本视频介绍了在感染的细支气管组织上建立猪离体肺细菌生物膜模型的实验方案。生物膜是嵌入于基质中并附着于表面的细菌聚集体。该模型用于研究细菌在不同生物膜形成阶段对抗生素的敏感性。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 离体猪肺（EVPL）组织的解剖与感染

1. 制备用于EVPL组织的SCFM，按照表1中提供的1 L改良SCFM配方进行配制。
2. 在解剖前，使用实验室中常规用于P. aeruginosa/S. aureus的琼脂（例如，LB琼脂+1.2%琼脂），制备所需细菌菌株的琼脂平板用于感染。
3. 计算实验所需的猪支气管组织块数量，包括未感染的对照组织块。将此数量乘以2，以便在两个重复肺组织中重复实验，以确认结果的可重复性。
4. 将所需组织块总数乘以0.5，以确定所需SCFM琼脂糖（mL）的体积，用于制备琼脂糖垫，确保每块组织有400 μL培养基，并额外预留SCFM琼脂糖以补偿移液误差或制备过程中的蒸发损失。
5. 每15 mL所需SCFM中加入0.12 g琼脂糖，以配制含0.8%（重量/体积）琼脂糖的所需总体积SCFM。
6. 加热SCFM琼脂糖溶液直至琼脂糖完全溶解。建议使用低功率家用微波炉加热，具体时间取决于微波炉功率。待琼脂糖冷却至约50 °C（手感温热但可安全持握），切勿进一步冷却。
7. 使用移液器，为每个所需组织块向24孔板的每孔中加入400 μL SCFM琼脂糖。
8. 将含SCFM琼脂糖的24孔板置于紫外线下灭菌10分钟。
9. 为每只完整肺组织的解剖准备三份重复洗涤液，每份含20 mL无菌Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和20 mL无菌Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基，并补充50 μg/mL氨苄青霉素。
10. 为每只待解剖的完整肺组织准备40 mL SCFM作为最终洗涤液。所有洗涤液可于4 °C保存过夜或立即使用。
11. 屠宰后应尽快从指定来源获取肺组织，并通过家用冷藏箱运输至实验室以保持低温。
    注意：屠宰当天获取的肺组织因储存导致的瘀伤较少，但屠宰后冷藏保存不超过4天的组织也可使用。由于冷藏箱需带入屠宰场或肉店，每次使用后必须根据当地实验室指南进行去污处理，且不使用时应存放于微生物实验室外，以降低污染风险和生物 containment 的破坏。
12. 在已灭菌的台面并在火焰下操作，将肺组织置于覆盖高压灭菌铝箔的洁净塑料砧板上。检查支气管是否保持完整。若在屠宰场或运输过程中造成任何损伤，则该肺组织不适用于实验。
13. 将调色刀在火焰下加热，并短暂触碰支气管周围肺组织区域，以灭菌组织表面。
14. 使用无菌固定剃刀片切除支气管周围的表面组织。切口应与支气管平行，以避免损伤。
15. 暴露支气管后，在可见最高点处对支气管进行横切，以分离支气管。
16. 使用无菌镊子轻轻夹住支气管游离端，并用无菌固定剃刀片切除任何残留的多余组织。在支气管分叉前进行最后一次横切，将支气管从肺组织中完全取出。
17. 将支气管放入第一份DMEM/RPMI 1640洗涤液中。保持在洗涤液中，并重复步骤1.12至1.15，从同一肺组织中采集足够数量的支气管节段，以满足计划实验所需的组织数量。
18. 将同一肺组织的其他支气管节段放入洗涤液中（步骤1.17）。在洗涤液中至少停留2分钟。
19. 从第一份DMEM/RPMI 1640洗涤液中取出支气管，将样本转移至无菌培养皿中。
20. 使用无菌镊子轻轻夹持每段支气管，避免损伤组织。尽可能去除残留软组织，并使用无菌解剖剪将组织切成约5 mm宽的条状。
21. 将所有支气管组织条放入第二份DMEM/RPMI 1640洗涤液中。在洗涤液中至少停留2分钟。
22. 使用无菌镊子从第二次洗涤液中取出组织条，注意避免损伤组织。将组织转移至洁净无菌的培养皿中。
23. 去除支气管上残留的软组织，并使用无菌解剖剪将组织条切成约5 mm × 5 mm的方块。
24. 向培养皿中加入第三份DMEM/RPMI 1640洗涤液。通过轻轻旋转培养皿使组织块在洗涤液中轻柔混匀。
25. 将第三份洗涤液从培养皿中倒出，但不移除组织块。
26. 向含组织的培养皿中加入最终SCFM洗涤液，确保所有组织块均被覆盖。
27. 将组织块在SCFM中置于紫外线下灭菌5分钟。
28. 使用无菌镊子将每块灭菌后的支气管组织转移至含SCFM琼脂糖垫的24孔板的各个孔中。
29. 为用目标细菌菌株感染每块组织，用连接于无菌0.5 mL胰岛素注射器的29 G针头尖端接触琼脂平板上的菌落，然后将针头轻触组织表面，轻微刺破组织。
    注意：使用配备29 G针头的胰岛素注射器可精确且舒适地持握针头，同时使手指远离针头和肺组织，提高安全性。也可使用未连接注射器的29 G针头完成此步骤，但需要更高的操作技巧，并增加针刺伤风险。胰岛素注射器易于获取。
30. 对于未感染对照组，使用连接于无菌0.5 mL胰岛素注射器的29 G针头尖端轻轻刺破每块组织表面。
31. 使用移液器向每孔加入500 μL SCFM。
32. 将每个24孔板的透气密封膜在紫外线下灭菌10分钟（材料表）。
33. 取下24孔板的盖子，替换为透气密封膜。
34. 将培养板在37 °C孵育所需的孵育（感染）时间，不进行振荡。检查未感染对照组织上是否无接种病原体的可见生长（污染对照）。
    注意：如需要，可在步骤1.31中向SCFM琼脂糖垫及覆盖用SCFM中添加氨苄青霉素至终浓度20 μg/mL。这将抑制肺组织上大多数内源性细菌的生长，但不影响P. aeruginosa或S. aureus的生长。然而，由于氨苄青霉素的存在可能影响对其他抗生素的敏感性，是否添加由使用者根据拟测试的菌株和抗生素自行决定。

表1

1. 用于合成囊性纤维化痰液培养基（SCFM）的制备 离体 猪肺模型

制备完成后，SCFM 应进行过滤除菌，并可在 4°C 下保存长达一个月。

a) 主配方
步骤 1	化学物质	用量	操作说明	在 1L SCFM 中的终浓度（mM）
	NaCl	3.03 g	将盐类和水加入洁净的瓶子中，该瓶子仅用于配制 SCFM	51.85
	KCl	1.114 g		14.94
	dH2O	640 ml		N/A
步骤 2	化学物质	以水配制的储备液浓度，经滤膜除菌后于 4°C 保存	操作说明	在 1L SCFM 中的终浓度（mM）
	Na2HPO4	0.125 M	向步骤 1 配制的盐溶液中加入每种储备液各 10 ml	1.25
	NaH2PO4	0.13 M		1.30
	NH4Cl	0.228 M		2.28
	KNO3	0.0348 M		0.35
	K2SO4	0.0271 M		0.27
	MOPS	1 M		10.00
步骤 3	化学物质		操作说明	在 1L SCFM 中的终浓度（mM）
	根据 b) 部分配制的 19 种氨基酸溶液		向步骤 1 和 2 配制的溶液中各加入 10 ml 每种氨基酸储备液	见 b) 部分
步骤 4	化学物质		操作说明	在 1L SCFM 中的终浓度（mM）
	根据需要使用 HCl 或 NaOH		用于将步骤 1–3 配制的溶液 pH 调整至 6.8。记录所加酸或碱的体积。	N/A
步骤 5	化学物质		操作说明	在 1L SCFM 中的终浓度（mM）
	dH2O		向步骤 1–4 配制的溶液中加水至终体积为 960 ml	N/A
步骤 6	化学物质	以水配制的储备液浓度，经滤膜除菌后于 4°C 保存	操作说明	在 1L SCFM 中的终浓度（mM）
	CaCl2	0.175 M	向步骤 1–5 配制的溶液中加入每种储备液各 10 ml	1.75
	MgCl2	0.0606 M		0.61
步骤 7	化学物质	以水配制的储备液浓度，经滤膜除菌后于 4°C 保存	操作说明	在 1L SCFM 中的终浓度（mM）
	L-乳酸	0.93 M	以水配制储备液，用 5 M NaOH 调 pH 至 7。向步骤 1–6 配制的溶液中加入 10 ml 该储备液。	9.30
步骤 8	化学物质	使用前临时以水配制的工作液浓度	操作说明	在 1L SCFM 中的终浓度（mM）
	Fe(III)SO4·7H2O	0.00036 M	先配制 0.036 M 的母液，经滤膜除菌后于 4°C 保存，只要溶液无沉淀即可长期使用。使用前，取 110 µl 母液加入 9.890 ml dH2O 中配成工作液，再将该工作液加入步骤 1–7 配制的溶液中。	0.0036

b) 氨基酸储备液的制备；使用前过滤除菌，并于 4°C 保存。
氨基酸	mM  储备液	操作说明	在 1 L SCFM 中的终浓度（mM）
丙氨酸 (Alanine)	178	溶于水	1.780
精氨酸 (Arginine)	30.6	溶于水	0.306
天冬氨酸 (Aspartate)	82.7	溶于 0.5 M NaOH	0.827
半胱氨酸 (Cysteine)	16	溶于水	0.160
谷氨酸 (Glutamic Acid)	154.9	溶于 1 M HCl	1.549
甘氨酸 (Glycine)	120.3	溶于水	1.203
组氨酸 (Histidine)	51.9	溶于水	0.519
异亮氨酸 (Isoleucine)	112.1	在摇床上加热至 50°C 30 分钟以溶于水	1.121
亮氨酸 (Leucine)	160.9	溶于水	1.609
赖氨酸 (Lysine)	212.8	溶于水	2.128
甲硫氨酸 (Methionine)	63.3	溶于水	0.633
鸟氨酸盐酸盐 (Ornithine-HCl)	67.6	溶于水	0.676
苯丙氨酸 (Phenylalanine)	53	溶于水	0.530
脯氨酸 (Proline)	166	溶于水	1.660
丝氨酸 (Serine)	144.6	溶于水	1.446
苏氨酸 (Threonine)	107.2	溶于水	1.072
色氨酸 (Tryptophan)	1.3	溶于 0.2 M NaOH	0.013
酪氨酸 (Tyrosine)	80.2	溶于 1 M NaOH	0.802
缬氨酸 (Valine)	111.7	溶于水	1.117

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰岛素注射器 - 0.5 mL，带29G针头	VWR	BDAM324892
24孔培养板
用于解剖器械表面消毒和灼烧灭菌的70%乙醇或类似物
用于制备铜绿假单胞菌/金黄色葡萄球菌划线的琼脂平板（任何合适的培养基）
琼脂糖
铝箔——经高压灭菌预消毒——用于覆盖解剖肺组织时所用的砧板。
用于多孔板的Breathe-easy或Breathe-easier密封膜	Diversified Biotech	BEM-1 或 BERM-2000
本生灯
砧板——我们推荐使用塑料砧板，以便用酒精轻松去污。
用于运输肺组织至实验室的冷藏箱
不同尺寸的解剖剪
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）
大型刮刀
安装好的剃须刀片
培养皿
塑料砧板和铝箔，用于创建无菌且可清洁的解剖操作表面
Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基
SCFM			如表1所列的试剂
镊子的选择（建议使用钝头镊子）
根据贵机构规定，用于处置受污染的锐器和猪肺组织的合适容器<支气管/> 健康 &以及安全政策。