眼前段解剖：一种从猪眼分离带角膜的前段组织的方法

摘要

来源：Boice, E. N., Snider, E. J. 用于追踪开放性眼球损伤及治疗效果的前房段器官培养平台。J. Vis. Exp. (2021)。

在本视频中，我们演示了猪眼球前段（含角膜）的解剖分离。分离得到的组织段可用于器官培养，以研究眼部疾病的病理生理学机制。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 组织解剖

1. 使用非无菌解剖工作台准备猪组织。
   1. 从当地屠宰场、动物实验或供应商处获取摘除的猪眼。运输过程中将眼球置于冰上，并浸没于磷酸盐缓冲液（PBS）中，收到后立即使用。
   2. 剪除眼眶外组织，修剪结膜，仅保留角巩膜壳和视神经。使用大号手术剪刀和镊子，在大体解剖工具包中于非无菌条件下进行解剖操作。
   3. 将眼球重新放入盛有新鲜PBS并置于冰上的容器中，直至所有实验所需眼球完成初步/大体解剖。
   4. 将眼球置于密闭容器中，浸入10%聚维酮碘溶液（Betadine）2分钟，随后无菌转移至生物安全柜II级（BSC II）中进行显微解剖（柜子#1）。后续所有操作均需在无菌条件下进行，以尽量减少实验设置过程中的污染。
2. 无菌条件下解剖前段结构。
   1. 在聚维酮碘溶液中处理2分钟后，将眼球依次转移至三份连续的无菌1×抗生素-抗真菌-PBS溶液（AA-PBS）中清洗，以去除眼表残留的聚维酮碘，同时保持眼组织的无菌状态。完成三次清洗后，将组织保存于AA-PBS中待用。
   2. 使用剃刀刀片/手术刀和弯头剪刀将眼球半切。将眼球置于经AA-PBS浸湿的纱布上，用无菌剃刀刀片或手术刀在眼球赤道附近（前段占40%，后段占60%的比例）做一初始切口。随后使用弯头手术剪沿此切口将眼球半切，分离出前段眼球（角膜半侧）。
      注意：前段结构的切口必须连续完整，避免巩膜边缘出现锯齿状或粗糙切口，否则在器官培养装置建立后可能导致液体泄漏。
   3. 使用显微剪刀作为铲具，从前段结构中刮除玻璃体。使用显微剪刀移除前段中的晶状体。将前段结构保留在AA-PBS中，待后续解剖步骤使用。
      注意：所有待解剖的眼球均可在此步骤暂存，并逐一继续完成后续解剖流程。
   4. 在解剖显微镜下，从虹膜向虹膜根部逐步呈放射状剪除虹膜组织，直至暴露小梁网（TM）。小梁网为一色素性组织，其纤维呈环状围绕角巩膜壳分布。小心地向虹膜根部剪切虹膜，可暴露位于组织下方的小梁网深层结构。
   5. 在与初始切口相同深度处，围绕虹膜做360°环形切开，以完全暴露整个小梁网区域。根据需要清除覆盖在小梁网上的任何残留虹膜组织。
   6. 修剪小梁网后方的睫状体残余部分，仅保留小梁网区域后方约1 mm宽的薄层组织。
   7. 将已完成解剖的前段结构（AS）置于培养基中，待后续在培养皿组装用生物安全柜II级（BSC II）中进行前段器官培养（ASOC）（柜子#2）。
      注意：若由单人完成解剖及器官培养培养皿的组装，所有眼球均可在此阶段暂存，待前段器官培养装置建立前再依次使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗抗	Gibco	15240-096
聚维酮碘	Fisher Scientific	NC1696484
棉签	Puritan	25-8061WC
精细镊子	World Precision Instruments	15914
纱布	Covidien	8044
大型镊子	World Precision Instruments	500365
大型手术剪刀	World Precision Instruments	503261
中型有齿镊子	World Precision Instruments	501217
PBS	Gibco	10010-023
培养皿（100 mm）	Fisher	FB0875713
刀片	Fisher	12-640
带盖无菌 100 mL 烧杯	VWR	15704-092
Vannas 剪刀	World Precision Instruments	WP5070