眼前段培养：一种用于培养猪眼带角膜眼前段的方法

摘要

来源：Boice, E. N., Snider, E. J. 用于追踪开放性眼球损伤及治疗效果的前房段器官培养平台。J. Vis. Exp. (2021)。

在本视频中，我们演示了从猪眼获取带角膜的前段眼球组织并进行培养的方法。该培养系统可作为研究眼外伤的实验模型。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 在器官培养皿中设置前房段

1. 将一个前段节段（AS）放入培养皿中，使AS倒置（杯口朝上）。使用蘸有培养基的棉签，轻轻擦拭角膜中心以去除任何色素。用镊子夹住眼球，并用同一棉签在巩膜周围擦拭以清除多余的色素。
2. 将AS翻转，并放置在培养皿底部的凸起区域上方，使角膜中心对准培养皿中的凸起部分。将夹紧环放置在新放置的AS上方。
3. 将四个螺丝插入对应的孔中，以固定夹紧环并使AS位于环下。使用L型扳手轻轻手动拧紧螺丝。
   注意： 在整个实验过程中每天都会进行拧紧操作，因此初始拧紧的目标是确保培养基不泄漏，同时避免损坏夹紧环。
4. 使用无菌的培养皿组件，将上盖盖在培养皿上并整体翻转。安装培养皿支架。将带O型圈的流体连接器连接到培养皿底部的螺纹接口上。
5. 在其中一个流体连接器上，连接一个18 G 90°弯曲针座、一段管路、一个18 G针座、一个尼龙注射过滤器、一个三通阀，以及一个装有培养基的20 mL注射器。
6. 在第二个流体连接器上，连接一个18 G 90°弯曲针座、一段管路、一个18 G针座、一个三通阀，以及一个无菌10 mL注射器的筒身部分（该部分将作为储液器，用于收集来自ASOC的液体和气泡）。
7. 将两个三通阀正确打开至注射器方向，通过步骤1.5中指定的流体连接端口，轻柔地推动培养基流经系统，以充盈AS、填满管路，并最终充满储液器。
   注意： 如果培养基渗入ASOC培养皿中，说明AS与夹紧环之间的密封不够紧密。
8. 通过轻柔推动培养基进入培养皿并翻转装置，将气泡推入储液器以去除气泡。
9. 将培养皿和支架竖直放置。在支架支脚下方放置一个培养皿的底部部分，注意不要缠绕管路。

2. 启动眼前段器官培养

1. ASOC 现已准备就绪，可进行孵育。将 ASOC 培养皿放入细胞培养孵育箱（37 °C，5% CO₂）中。确保已知并记录 ASOC 培养皿在孵育箱内相对于压力传感器的高度，以便准确计算眼内压（IOP）。
2. 将管路从 37 °C、5% CO₂ 孵育箱门底部引出，避免妨碍箱门的正常开关。将 20 mL 注射器连接至设定流速为 2.5 µL/min 的注射泵。
3. 将带有储液器的管路置于压力传感器仪器端，连接侧向三通阀至压力传感器装置，同时使 PBS 在管路中持续流动，以防止气泡进入管路。
   注意：系统设置完成后，应将储液器中的 PBS 排空，以减少器官培养期间因微生物生长导致储液器污染的可能性。
4. 开始 IOP 数据采集前，首先确认已插入 microSD 卡用于保存数据文件，随后打开压力传感器装置以开始数据采集。

3. ASOC的日常维护

1. 在ASOC平衡24小时后，将其从37 °C、5% CO₂ 培养箱中取出，并放入II级生物安全柜（BSC）中。
   注意：在压力数据采集过程中，当ASOC从培养箱中取出（高度变化）并在柜内调整时，这些时间段在数据上会表现为尖峰。
2. 检查培养皿下方每个孔位是否存在泄漏。若发现泄漏，应检查培养皿下方的流体连接是否紧密，必要时重新拧紧。使用无菌L型扳手拧紧夹紧环上的螺丝，以检查培养皿上盖是否存在泄漏。
   注意：AS巩膜组织在24小时内会因压缩而厚度减小，因此需要重新拧紧夹紧环。
3. 吸除培养皿孔中的培养基。
   注意：小梁网正在过滤从泵入ASOC的培养基中渗出的液体，因此在ASOC培养皿边缘区域会有培养基存在。
4. 重复步骤1.7和1.8，以排除任何滞留的气泡。
5. 重新填充注射泵上的注射器，确保注射泵正常运行，并确认阀门位置正确以实现向ASOC的灌注。随后将ASOC培养皿放回37 °C、5% CO₂ 培养箱中。
   注意：理想情况下，这些步骤应每天执行一次。然而，使用20 mL的初始培养基体积、ASOC培养皿孔的容量以及2.5 µL/min的泵速，足以支持系统连续数天稳定运行而无需干预。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10-32 聚碳酸酯直插式接头，外螺纹管接头	McMaster-Carr	51525K431
10-32 内六角圆柱头螺钉，½"	McMaster-Carr	92196A269
10 mL 注射器	BD	302995
20 mL 注射器	BD	302830
Anti-Anti	Gibco	15240-096
球头L型扳手	McMaster-Carr	5020A25
BD Intramedic PE 160 管路	Fisher Scientific	14-170-12E
棉签	Puritan	25-8061WC
DMEM 培养基	ATCC	30-2002
FBS	ATCC	30-2020
精细镊子	World Precision Instruments	15914
Glutamax	Gibco	35050-061
耐高温硅胶O型圈，宽2 mm，内径4 mm	McMaster-Carr	5233T47
钉子（穿刺物）	McMaster-Carr	97808A503
尼龙注射器滤器	Fisher	09-719C
PBS	Gibco	10010-023
聚碳酸酯三通旋塞阀，带公 鲁尔 锁接头	Fisher	NC9593742
不锈钢18 G 90度 角式分配针头	McMaster-Carr	75165A81
不锈钢18 G 直型 ½'' 分配针头	McMaster-Carr	75165A675