猪心室组织切片的制备：一种基于振动切片机的猪心脏组织超薄切片技术

摘要

来源：Ou, Q. 等，生理条件下猪心脏的切片与培养，J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种基于振动切片机的方法，用于制备具有活性的猪心脏超薄切片。所获得的组织切片可用于培养，并作为药理学检测的模型系统。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 猪心脏组织切片

1. 在振动切片机上安装组织浴槽，向组织浴槽的冷却夹套中加入冰块，然后向组织浴槽中加入Tyrode's溶液。准备一个1 L的塑料瓶，用于收集组织浴槽冷却夹套融化的冰水。配制1 L切片用Tyrode's溶液：每升溶液中加入3 g/L 2,3-丁二酮单肟（BDM）、140 mM NaCl（8.18 g）、6 mM KCl（0.447 g）、10 mM D-葡萄糖（1.86 g）、10 mM HEPES（2.38 g）、1 mM MgCl₂（0.203 g）、1.2 mM NaH₂PO₄（0.136 g）和2.5 mM CaCl₂（0.277 g）。₂ (1 mL 的 1 M 溶液)，1.8 mM CaCl₂₂ （1.8 mL 1 M 溶液），加 ddH₂O 定容至 1 L₂O. 使用 NaOH 将 pH 调至 7.40。然后使用 1,000 mL、0.22 µm 真空过滤/储存系统过滤溶液，并于 4 °C 下过夜保存。
2. 在生物安全柜内，将猪心转移至含有1 L新鲜冷停跳液的托盘中。配制1 L停跳液：混合110 mM NaCl（6.43 g）、1.2 mM CaCl₂（0.132 g）、5.4 mM KCl（0.401 g）、0.5 mM MgCl₂（0.051 g）、20 mM HEPES（4.77 g）、10 mM葡萄糖（1.80 g）和0.3 mM肌酸（0.038 g），用去离子水溶解，调节pH至7.4。₂ （1.2 mL 1 M 溶液），16 mM KCl（1.19 g），16 mM MgCl₂₂ (3.25 g)，10 mM NaHCO₃₃ (0.84 g)，1 U/mL 肝素，加 ddH₂O 至 1 L₂O. 使用 NaOH 将 pH 调至 7.40。然后使用 1,000 mL、0.22 µm 真空过滤/储存系统过滤溶液，并于 4 °C 下过夜保存。
   注意： 在切片当天，向停跳液中加入1,000 U/L肝素。 
3. 使用可伸缩的无菌手术刀解剖心脏，分离左心室。然后将左心室切成1−2 cm的组织块³ 每次使用剃须刀片进行切割。取其中一片用于切片，其余部分保存在装有冰冷Tyrode's溶液的50 mL离心管中，并置于冰上，以备后续切割使用。
   注意： 在切片前用手按摩组织，尤其是第二个组织块。按摩有助于恢复心肌纤维的正常排列，并防止心肌组织块内出现僵硬。
4. 加入1−2滴组织胶（材料表) 固定到金属样品台上，并贴上一块表面积约为1 cm²的4%琼脂块².
5. 在琼脂上加入1−2滴组织胶。
6. 将心脏组织块的心外膜面向下贴附于琼脂上，使其紧贴组织胶，并确保尽可能平整。然后，将带有心脏组织块的组织托架转移至振动切片机切片槽中的指定位置。
7. 将氧气管连接至切片浴槽以及盛有Tyrode's溶液的金属托盘（用于收集切片的充氧Tyrode's浴槽）。然后，在金属托盘中放入40 µm细胞筛网，以便在切片完成后收集切片。
8. 调整切片位置
   1. 使用振动切片机操作软件和控制面板，调节刀片/样本的高度。选择 高度 按钮，并按照屏幕上的说明调整高度。理想情况下，刀片应接近组织顶部，但位于乳头肌下方，并确保在切片前液体已覆盖组织和刀片。
   2. 通过选择调整开始切片组织的位置 推进 按钮。按下 切片 按钮，并使用旋钮调节速度，使刀片向组织边缘移动。然后，按压 切片 再次停止，并按下 进展 按钮以终止该过程。
   3. 调整切片参数：进给速度 = 0.03 mm/s，振动频率 = 80 Hz，水平振动幅度 = 2 mm。然后，通过选择开始切片 切片 按钮
   4. 让振动切片机持续切片，直至切到组织末端，但尚未触及标本夹持器后端为止。此时，按下 切片 再次停止。按下 返回 返回起始位置的按钮。
   5. 选择 自动重复 （连续点击两次），可使振动切片机自动重复切片过程，最多可达99次。
9. 收集切片
   1. 待切片达到完整长度且形态良好（即已切过乳头肌层）后，开始收集切片。
   2. 使用装有冷台氏液的塑料巴氏吸管从浴槽中收集切片，轻轻吸取组织。如果组织仍与心脏组织块相连，必要时可使用镊子和弹簧剪将切片分离。
   3. 将切片转移至含氧合Tyrode's溶液的浴槽中的一个细胞筛网上（见步骤1.7），使用塑料巴斯德吸管中的液体使组织平铺于细胞筛网上，然后在上方放置一个金属垫圈以固定组织。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Bioline USA	BIO-41025
2,3-丁二酮单肟（BDM）	Fisher	AC150375000
氯化钙（CaCl2）	Fisher	C79-500
振动切片机用陶瓷刀片	Campden Instruments	7550-1-C
D-葡萄糖	Fisher	D16-1
一次性手术刀 #20	Biologyproducts.com	DS20X
Falcon 细胞筛，无菌，Corning	VWR	21008-952
肝素钠盐	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
HEPES	Fisher	BP310-1
Histoacryl BLUE 组织胶	Amazon		https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/
虹膜弹簧剪	Fisher	NC9019530
虹膜直剪	Fisher	731210
氯化镁（MgCl2）	Fisher	M33-500
氧气调节器	Praxair
氧气瓶	Praxair
塑料巴斯德吸管	Fisher	13-711-48
氯化钾（KCl）	Fisher	AC193780010
矩形剃须刀片	Fisher	12-640
可伸缩手术刀	Fisher	22-079-716
碳酸氢钠（NaHCO3）	Fisher	AC217125000
氯化钠（NaCl）	Fisher	AC327300010
振动切片机	Campden Instruments	7000 SMZ-2