猪卵丘卵母细胞复合体的分离：一种用于体外受精的从猪卵巢卵泡中分离卵丘卵母细胞复合体的技术

摘要

来源：Gorczyca, G. 等，用于猪卵母细胞包封的蛋白酶降解海藻酸盐水凝胶与疏水性微型生物反应器。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频介绍了从猪卵巢中分离卵丘-卵母细胞复合体（COC）的技术。分离得到的完整COC可用于体外受精实验——这是一种辅助生殖技术，可用于开发生育治疗方案。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 猪卵丘-卵母细胞复合体的分离

1. 为获取用于分离卵巢卵泡的材料，需在当地屠宰场摘取未成年母猪（约6-7月龄，体重70至80公斤）的卵巢。每次实验从10只动物中选取约20个猪卵巢，用于卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的分离。
   注意：假设每个卵巢可获得3–5个卵泡，则卵泡总数在60至100个之间。
2. 将卵巢置于装有无菌磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4；38 °C）并含有1%抗真菌溶液（AAS）的保温瓶中。确保实验材料在1小时内运送至实验室，并用含抗生素的无菌PBS冲洗两次。
3. 冲洗卵巢后，将其转移至盛有操作培养基（HM）（材料表）的烧杯中，并在所有操作期间置于38 °C培养箱中保存。
   注意：为在卵母细胞操作过程中获得最佳效果，所有操作应在DMEM/F12培养基（操作培养基，HM）中进行，添加2.5%抗生素/抗真菌溶液和10%胎牛血清（FBS），并在带有温度控制（38 °C）的加热台和层流罩内操作，同时通过控制环境中的CO₂水平维持pH值，以最大限度减少细菌污染。
4. 从大型猪卵泡（直径6-8 mm）中通过抽吸收集卵泡液（FF），并在室温下以100 x g离心10分钟。随后，使用连接0.2 μm膜孔滤器的无菌注射器过滤上清液，并立即在-80 °C下速冻保存。
   注意：抽吸卵泡液时使用胰岛素注射器（u-40）。
5. 确保仅选择健康、中等大小的卵泡（直径4-6 mm）用于COCs的分离。
   注意：I级COCs，其卵母细胞完整且呈圆形，胞质均匀，卵丘细胞多层（至少3-4层）且致密，适用于后续的三维体外成熟（3D IVM）程序。
6. 为分离COCs，将2-3个卵巢转移至盛有HM的无菌10 cm直径培养皿中。通过以下任一方法从中等大小的卵泡中分离COCs。
   1. 使用无菌手术刀片15C轻轻切开突出的卵巢卵泡表面，使卵泡液连同COCs流出至培养皿中。
   2. 使用连接一次性注射器、规格为28 G、长度5/8”的针头抽吸卵泡内容物，并将其转移至培养皿中。
      注意：弃去卵巢组织残余。后续的分离步骤在体视显微镜下进行。
7. 准备3–5个60 mm的体外受精（IVF）培养皿。
   1. 向中央孔中加入1 mL HM，并在其外圈放置3-4滴HM（每滴50 μL）。
   2. 然后，使用聚碳酸酯微量移液管将完好的COCs转移至外圈的HM液滴中，短暂冲洗3-4次。
   3. 最后，将COCs逐个转移至中央孔中。将这些IVF培养皿存放于培养箱中，用于后续操作。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
常规
抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩液）100 ml	Thermo Fisher	15240062	处理液中终浓度为2.5%。PBS中为1%（步骤1.2）
DMEM/F12（500 ml）	Sigma-Aldrich	D8062	处理液
FCS（100 ml）	Thermo Fisher	16140063	处理液中终浓度为10%（步骤：1.5）
PBS（1×，pH 7.4）500 ml	Thermo Fisher	10010023
成熟培养基
hCG（1瓶，10,000 U）	Sigma-Aldrich	CG10
PMSG	BioVendor	RP1782721000
专用仪器与工具
30 mm 培养皿	TPP	93040
60 mm 体外受精培养皿	Falcon	353653
培养箱	Panasonic	MCO-170AIC-PE	可使用其他品牌
无菌培养皿（10 cm）	NEST Biotechnology	704002
保温瓶	Quechua	5602589	可使用其他品牌