Liquid Marble 微型生物反应器系统:用于猪卵母细胞包埋的 3D 培养方案

摘要

来源:Gorczyca， G. 等人 用于猪卵母细胞封装的蛋白水解降解海藻酸盐水凝胶和疏水微生物反应器。J. Vis. Exp. （2020 年）。

在本视频中，我们描述了一种在疏水微生物反应器中封装猪卵母细胞的方案。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 超疏水性氟化乙烯丙烯 （FEP） 微型生物反应器中的封装。

注意:确保所有体外成熟 （IVM） 程序都在恒温控制的桌子上进行，并且卵丘-卵母细胞复合物 （COC） 在整个处理过程中保持在 38 °C。

1. 准备一个 30 mm 培养皿，含有 5 g FEP 粉末床 - 平均粒径为 1 μm
   注意:使用新鲜的 FEP 粉末很重要。重复使用的 FEP 往往会聚集并形成团块。
2. 将含有 3-5 个 COC 的单滴成熟培养基 （MM）（体积为 ~30 μL）分配到 FEP 粉末床上。以圆周运动轻轻旋转板，以确保这些颗粒完全覆盖液滴表面并形成液弹珠 （LM）。
3. 使用带有 1,000 μL 吸头的移液器吸取形成的 LM><。 注意:在边缘切割移液器吸头，使其适合 LM 的直径 （4-5 mm）。这种准备好的尖端的近似直径应略大于 LM 的直径。
4. 准备几个 60 毫米体外受精 （IVF） 培养皿。向外环中加入 3-4 mL 无菌水以准备湿度室。接下来，将一个 LM 放入中心孔中。
   注意:此过程需要良好的手工技能和精确度 - 如果弹珠不小心放置或从低处掉落，它就会被破坏。
5. 将大理石在 38 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中孵育 4 天。
   1. 按照程序每天更换培养基:在每个 LM 上涂抹 30 μL MM，这会导致它们扩散，因为直接液体接触会破坏涂层 FEP 粉末的疏水性。当大理石内容物溶解时，将从生物反应器释放的 COC 转移到培养皿中的一滴新鲜 MM 中。
      注意:要精确转移释放的 COC，请使用聚碳酸酯微量移液器。
   2. 在 MM 中洗涤数次（3-4 次）以去除 FEP 颗粒后，用 30 μL 新鲜 MM 将其转移到 FEP 粉末床上。以圆周运动轻轻旋转板，以确保粉末颗粒完全覆盖液滴表面并形成新的 LM。
   3. 使用带有 1,000 μL 吸头的移液器吸取形成的 LM。
   4. 向外环中加入 3-4 mL 无菌水以准备湿度室。接下来，将一个 LM 放入 IVF 培养皿的中心孔中。
      注:FEP 粉末的透明涂层允许使用光学显微镜监测 LM 含量。

材料