液态弹珠微生物反应器系统：一种用于包封猪卵母细胞的三维培养方案

摘要

来源：Gorczyca, G.，等。用于猪卵母细胞包封的蛋白酶降解海藻酸盐水凝胶与疏水性微型生物反应器。J. Vis. Exp. (2020)。

在本视频中，我们介绍了一种将猪卵母细胞包封于疏水性微生化反应器中的实验方案。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 超疏水氟化乙烯丙烯（FEP）微生物微反应器中的封装。

注意：确保所有体外成熟（IVM）操作均在恒温控制台上进行，且卵丘-卵母细胞复合体（COCs）在操作过程中始终保持在38 °C。

1. 准备一个含有5 g FEP粉末（平均粒径为1 μm）的30 mm培养皿
   注意：必须使用新鲜的FEP粉末。重复使用的FEP容易发生聚集并形成团块。
2. 将一滴成熟培养基（MM）（体积约30 μL），其中含有3-5个卵丘-卵母细胞复合体（COCs），滴加到FEP粉末床表面。轻轻旋转培养皿，使其呈圆周运动，确保粉末颗粒完全覆盖液滴表面，形成液态弹珠（LM）。
3. 使用带有1,000 μL吸头的移液器拾取已形成的液态弹珠（LM）。
   注意：将移液器吸头边缘剪裁，使其直径适配液态弹珠（4-5 mm）。制备后的吸头直径应略大于液态弹珠的直径。
4. 准备数个60 mm体外受精（IVF）培养皿。在外圈加入3-4 mL无菌水，以构建湿度环境。随后，将一个液态弹珠（LM）放入中央小室中。
   注意：该操作需要良好的手动技巧和精确性——若液态弹珠放置不当或即使从较低高度跌落，都会导致其破裂。
5. 在38 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育液态弹珠4天。
   1. 每天更换培养基，操作步骤如下：在每个液态弹珠（LM）上加入30 μL成熟培养基（MM），这将导致其展开，因为直接的液体接触会破坏包覆FEP粉末的疏水性。当液态弹珠内容物溶解后，使用聚碳酸酯微量移液器将释放出的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）转移至培养皿中的新鲜MM液滴中。
      注意：为精确转移释放的卵丘-卵母细胞复合体（COCs），建议使用聚碳酸酯微量移液器。
   2. 用成熟培养基（MM）清洗数次（3-4次）以去除残留的FEP颗粒后，将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）连同30 μL新鲜MM转移至FEP粉末床上。轻轻旋转培养皿，使其呈圆周运动，确保粉末颗粒完全覆盖液滴表面，重新形成新的液态弹珠（LM）。
   3. 使用带有1,000 μL吸头的移液器拾取新形成的液态弹珠（LM）。
   4. 在外圈加入3-4 mL无菌水以构建湿度环境。随后，将一个液态弹珠（LM）放入IVF培养皿的中央小室中。
      注意：FEP粉末形成的透明包覆层允许使用光学显微镜观察液态弹珠（LM）内部情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
成熟培养基
hCG（1 瓶，10,000 U）	Sigma-Aldrich	CG10
PMSG	BioVendor	RP1782721000
DMEM/F12（500 ml）	Sigma-Aldrich	D8062	成熟培养基
FCS（100 ml）	Thermo Fisher	16140063	成熟培养基中终浓度为 10%
液态弹珠
FEP	Dyneon GmbH 3M AdMD	A-66670
专用仪器与工具
30 mm 培养皿	TPP	93040
60 mm 体外受精培养皿	Falcon	353653
Ez-Grid Premium 细胞操作移液器	RI Life Sciences	8-72-288
Ez-Tip	RI Life Sciences	8-72-4155/20
培养箱	Panasonic	MCO-170AIC-PE	可使用其他品牌
无菌培养皿（10 cm）	NEST Biotechnology	704002