激光辅助选择性消融猪角膜内皮细胞：一种用于离体研究的聚焦性猪角膜内皮损伤诱导技术

摘要

来源：Holzhey, A. 等，开发一种非侵入性激光辅助的角膜内皮细胞丢失实验模型。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种非侵入性的激光辅助方法，用于选择性损伤猪眼的角膜内皮细胞。所建立的角膜内皮细胞损伤离体模型可用于研究角膜内皮相关疾病。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 器官培养的准备与激光处理

1. 从当地屠宰场获取新鲜摘除的猪眼。将其置于含高糖的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，该培养基添加 L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素/链霉素（1%）和猪血清（10%），并在整个文章中将此培养基简称为完全培养基，保存时保持低温（4 °C）。
2. 使用剪刀去除眼外组织，将眼球在 5% 聚维酮碘眼科溶液中浸泡 5 分钟，随后转移至无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，待用。
3. 使用谱域光学相干断层扫描仪（材料表）筛查眼前节主要病变，如角膜瘢痕、水肿及其他混浊情况。
4. 将眼球置于配备 Nd:YAG 激光器（材料表）的裂隙灯装置前方，该激光器波长为 1,064 nm，在空气中的聚焦光斑直径为 10 µm。
   注意：为实现最佳定位，使用一个 3D 打印的固定装置，其设计可牢固固定眼球，同时避免施加过大压力（图 1）。
5. 采用 12 倍放大倍率，并偏转照明光路以清晰观察角膜各层结构。
6. 设定脉冲能量（例如 1.6 mJ）和聚焦点位置（例如 0.16 mm），以实现对角膜内皮细胞的选择性消融。
7. 在靠近角膜缘处进行透明角膜穿刺，注入粘弹剂（材料表），以稳定前房结构。
8. 使用直径 8 mm 的角膜环钻切除经激光处理的中央角膜区域。
9. 将切除的角膜组织置于 12 孔板的一个孔中，内皮面朝上，加入 3 mL 完全培养基，在 37 °C 条件下孵育最多 3 天。
   注意：在此步骤中，可向培养基中添加潜在的细胞保护剂。

结果

图1：实验装置。（A）眼球被固定在一个部分为3D打印的夹持装置中，以便相对于激光束进行精确定位。（B）激光处理前，使用眼前节光学相干断层扫描仪评估组织，以检查是否存在主要的眼前节病变。焦点激光点的位置以0.0 mm（黑色星号）、0.1 mm（红色星号）和0.2 mm（蓝色星号）为例标示。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
巴伦真空环钻 	Katena	K20-2058
冷冻切片机	Leica	CM 3050S
杜尔贝科改良伊格尔培养基-高糖	PAA	E-15009
眼球固定器	自制	N/A
倒置显微镜	Leica	DMI 6000 B
KH2PO4	Merck	529568
Na2HPO4	Merck	1065860500
Nd:YAG 激光器	Zeiss Meditec	visuLAS YAG II plus
OCT 包埋剂 Tissue Tek	Sakura Finetechnical	4583
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4333
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Gibco	10010056
猪血清	Sigma-Aldrich	12736C
谱域光学相干断层扫描仪	Heidelberg Engineering	Spectralis
12 孔组织培养板	Sarstedt	833921
粘弹性物质	OmniVision	Methocel