向兔模型上泪腺睑部注射：一种诱导干眼病的技术

摘要

来源：Honkanen, R. A. 等，et al. 通过将刀豆球蛋白 A 注射至泪腺建立兔的水样缺乏型干眼病模型：用于药物疗效研究。 J. Vis. Exp. (2020)。

在本视频中，我们展示了一种通过向兔上泪腺的睑部注射刀豆球蛋白A来诱导水液缺乏型干眼病的方法。该模型可用于干眼病治疗药物的药代动力学和生物分布研究。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 动物与饲养

1. 获取体重为 2-3 kg 的新西兰白兔（NZW）。
2. 将兔子单独饲养在笼中，严格控制温度（65 ± 5 °F）和湿度（45 ± 5%），光照应保持 12 小时开/12 小时关的循环周期。
3. 提供自由饮水和标准兔粮。避免使用饮食补充剂，因其可能含有影响眼睛的维生素 A。
4. 在进行基线测量或诱导干眼症之前，至少让动物适应环境 2 周。

2. 麻醉与安乐死方法

注意： 所有操作均需轻度镇静，但 Con A 注射需要中度镇静。

1. 对于轻度镇静，使用26号针头在肩部上方皮下注射乙酰丙嗪（1 mg/kg）。轻度镇静的终点指标：动物保持头部放松姿势，耳叶不再完全直立。
   注意： 如果未达到适当的终点，可追加一次乙酰丙嗪注射。动物应始终保持清醒，对胡须触碰有反应，且绝无呼吸减慢现象。
2. 对于中度镇静，首先按上述方法给予动物乙酰丙嗪。达到终点后（见上文注释），使用带有氧气的面罩给予异氟烷₂ 流速设定为1 L/min，异氟烷输送浓度设定为5%（图1).
3. 使用异氟烷麻醉，直至兔子的躯体张力完全松弛且耳朵完全下垂。
   注意： 动物侧卧时不应出现代偿性肌肉运动；呼吸始终保持自主状态。
4. 自发恢复通常在2-5分钟内发生：表现为自发的头部运动以及肌张力增加或恢复正常。在实验操作完成后，若动物处于中度镇静状态，需继续观察兔子约30分钟，或直至其行为恢复正常。
   注意： 眼科软膏在两种形式的镇静过程中均不需要。1）在轻度镇静中，动物仍保持警觉，并维持眨眼反射；在中度镇静中，眨眼反射受到的抑制时间极短，不足以对眼表造成风险。2）将眼科软膏涂抹于眼表会妨碍检测过程中对眼部结构的观察。
5. 安乐死：使用过量静脉注射戊巴比妥（100 mg/kg）。

3. 干眼症的诱导与治疗

注意：需注射眶部泪腺系统的三个部分。

1. 皮下注射 0.2 mg/kg 的乙酰丙嗪使兔子镇静。
2. 剪除眶周及头皮区域的毛发，并使用 Nair 彻底清除残留毛发。保持皮肤完全光滑，以便更清晰地观察解剖标志，并进行超声引导下刀豆蛋白 A 的注射（图 2）。
3. 按照上述方法诱导中度镇静。
4. 上泪腺睑部（PSLG）的注射
   注意：应首先进行 PSLG 的注射。
   1. 使用微量移液器向相应眼睛滴加 25 µL 无防腐剂的 1% 利多卡因。
   2. 翻转上眼睑，并对眶缘后部施加轻柔的内侧压力，直至可见标记腺体睑部的隆起。PSLG 表现为上眼睑后部（颞侧）的一个小的结节状隆起。
      注意：在学习过程中，如需观察腺体组织，可在该区域滴加 5% 荧光素钠（图 3A）。可见泪液从结节状的 PSLG 处流出。荧光素钠的使用并非 Con A 给药所必需，仅用于图示目的以显示腺体组织。
   3. 使用细齿镊子和连接结核菌素注射器的 27 号针头，经结膜直接穿刺进入腺体。将针头推进至组织内 2 mm，注入 500 µg Con A，体积为 0.1 mL（图 3B）。
      注意：该注射有时会引起疼痛。如有必要，可在异氟烷麻醉下完成此注射。

结果

图1：气体面罩镇静。 本照片显示使用异氟烷通过气体面罩提供短暂中度镇静。

图 2：兔用于刀豆球蛋白 A 注射前的准备。 (A) 使用小型剪刀去除毛发，以便更清晰地观察解剖标志，从而识别眶上泪...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
27 号针头（5/8）	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ	305921	用于向泪腺注射 ConA 的针头
Aceproinj（乙酰丙嗪）	Henry Schein Animal Health, Dublin, OH	NDC11695-0079-8	以 0.1 ml/kg 剂量进行皮下注射，用于兔的镇静
麻醉挥发器	VetEquip, Pleasanton, CA	Item #911103
Bishop Harmon 镊子	Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ	E1500-C	组织镊
刀豆球蛋白 A（Concanavalin A）	Sigma, St. Louis, MO	C2010	用 PBS 配制成 5 mg/ml 溶液，用于注射至兔泪腺
荧光素（fluorescein）	AKRON, Lake Forest, IL	NDC17478-253	用 PBS 稀释至 0.2%，用于测量泪膜破裂时间（TBUT）
异氟烷（Isoflurane）	Henry Schein, Melville, NY	29405
利多卡因（lidocaine）	Sigma, St. Louis, MO	L5647	用 PBS 配制成 1% 溶液，作为麻醉剂使用
PBS（磷酸盐缓冲液，phosphate buffered saline）	Mediatech, Inc. Manassas, VA	21-031-CV
兔，新西兰白兔或荷兰带状兔（如文中所述）	Charles River Labs, Waltham, MA	2-3 kg	实验动物
手术放大镜 +1.50	Designs for Vision, Bohemia, NY	Specialty item	在观察泪膜破裂及进行刀豆球蛋白 A 注射时，提供眼表放大功能。