猪主动脉内皮细胞（pAEC）分离：一种基于酶消化法从收获的猪腹主动脉中分离内皮细胞的方法

摘要

来源：Zhao, Y. 等 小型猪主动脉内皮细胞的分离与原代培养。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们演示了使用一步胶原酶消化法从猪模型的腹主动脉中分离内皮细胞。这些内皮细胞可进行培养，用于后续实验应用。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 猪主动脉内皮细胞的分离

1. 在无菌条件下，将猪主动脉从洗涤缓冲液中取出，置于150 mm的培养皿中（图1A）。
2. 用无菌镊子和剪刀小心剪除主动脉的两端，并再次去除主动脉周围的多余组织（图1B）。在室温下的培养皿上方，用20−50 mL洗涤缓冲液冲洗主动脉的内外表面：含1%（v/v）青霉素/链霉素的1×PBS溶液（pH 7.4）。
   注意：尽量仅剪除手术中夹钳夹持区域的组织，因为该区域的内皮细胞可能已受损，同时去除多余组织和动脉侧支。
3. 将外科缝合线穿过主动脉，然后用外科缝合线（5-0，90 cm，材料表）结扎主动脉的一端。将缝合线保留在主动脉内侧（图1C,D）。
4. 用镊子轻轻固定结扎端附近的主动脉，然后缓慢拉动外科缝合线，将主动脉翻转，直至暴露其内皮表面（图1E−G）。
   注意：务必固定结扎端附近的主动脉，且不要夹持过紧，否则无法通过拉动缝合线实现主动脉翻转。
5. 用洗涤缓冲液清洗主动脉内皮表面3次（每次10 mL），然后弃去清洗液。将主动脉放入15 mL离心管中，并在管内加入10 mL 0.005% IV型胶原酶消化液覆盖主动脉（图1H）。
   注意：消化前将0.005% IV型胶原酶消化液预热至37 °C。
6. 在37 °C孵育15分钟。将消化后的主动脉及消化液转移至100 mm培养皿中，加入10−15 mL预冷的终止缓冲液（含10%热灭活胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基），以终止0.005% IV型胶原酶的作用。
   注意：推荐消化时间为10至20分钟。确保主动脉的内皮表面被终止缓冲液完全覆盖。
7. 使用细胞刮棒沿单一方向轻轻刮取主动脉内表面的pAECs（图1I）。用洗涤缓冲液清洗刮取后的主动脉3次（每次5 mL）。将培养皿中的液体转移至50 mL离心管中。再用洗涤缓冲液冲洗培养皿底部2次（每次5 mL），并将冲洗液再次转移至50 mL离心管中。
   注意：刮取时应轻柔，避免压迫组织，不要触碰边缘和孔洞区域。建议刮取5−8次。
8. 在4 °C条件下以600 × g离心6分钟。弃去上清液，保留50 mL离心管底部约10 mL液体。向50 mL离心管中加入20 mL洗涤缓冲液，重悬细胞沉淀。此步骤应避免产生气泡。
9. 在4 °C条件下以600 × g离心6分钟。缓慢弃去上清液。用1 mL培养基重悬细胞沉淀，并充分混匀。
   注意：每厘米主动脉平均可获得1.9 × 10⁵ ± 1.4 × 10⁴个内皮细胞（均值 ± 标准差，n = 3）。
10. 使用细胞计数仪对细胞进行计数。根据细胞数量，将细胞接种并培养于未经任何包被处理的培养容器中。若细胞数量小于或等于1.0 × 10⁶，使用25 cm²培养瓶进行培养；若细胞数量大于1.0 × 10⁶，则使用多个25 cm²培养瓶（每瓶接种1.0 × 10⁶个细胞）。将培养瓶置于37 °C、5% CO₂的培养箱中静置培养，每2−3天更换一次培养基。
    注意：部分细胞可能因刮取操作而受损。细胞活力检测显示活细胞比例为95.7% ± 1.7%（均值 ± 标准差，n = 3）。分离获得的细胞倍增时间约为1−2天。

结果

图1：猪主动脉消化及pAECs的分离。(A) 将主动脉置于含冷洗涤缓冲液的150 mm培养皿中。(B) 去除结缔组织后的猪主动脉照片。(C) 用无菌外科缝线绑住的玻璃棒，用于穿过猪主动脉。(D) 将主动脉一端用无菌外科缝线结扎，并保留在主动脉内侧。<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞刮刀	Corning	3010#
IV型胶原酶	Sigma-Aldrich	C5138#-1G
DMEM培养基	Life Technologies	11965118#
Falcon 100 mm细胞培养皿	Corning	353003#
培养皿（150 × 15 mm）	Biologixgroup	66-1515#
镊子	上海医疗器械有限公司 中国
带通气盖的斜颈矩形细胞培养瓶（T25）	Corning	3289#
剪刀	上海医疗器械有限公司 中国
血清移液管（10 ml）	JET Biofil	GSP010010#
无菌巴斯德吸管	GeneBrick	GY0025#
外科缝合线	上海浦东金环医用材料有限公司	5-0#
20 × PBS溶液（pH 7.4，无核酸酶）	生工生物工程（上海）股份有限公司	B540627#
青霉素/链霉素 	Life Technologies 	15070063#