分离短后睫状动脉：一种从猪眼完整切除短后睫状微血管的实验方案 关键词：短后睫状动脉，微血管分离，猪眼，眼血流，血管功能，实验模型

摘要

来源：Perumal, N. 等，眼微血管蛋白质组学质谱分析的样品制备。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了从猪眼分离短后睫状动脉的实验方案。分离得到的短后睫状动脉是研究眼部血管分子机制和蛋白质谱的适宜材料。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 短后睫状动脉的分离

猪眼连同视神经和眼外组织在死后立即获取。摘除的眼球被置于冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中运输至实验室，并立即使用。

注意：猪眼基本分为眼前段（图1A）和眼后段（图1B）。

1. 将眼球置于含有冰冻 Krebs-Henseleit (K-H) 缓冲液的解剖皿中。使用一对锋利的梅奥剪刀仔细剪除周围肌肉和组织。
   注意：配制 Krebs-Henseleit (K-H) 缓冲液时，称取以下试剂：27.68 g NaCl、8.4 g NaHCO₃、1.4 g KCl、1.18 g MgSO₄ 和 0.64 g KH₂PO₄，放入一个干燥洁净的 50 mL 圆锥形离心管中；另取 1.47 g CaCl₂ 和 8.0 g 葡萄糖放入另一管中。这些化学试剂的粉末混合物应储存在阴凉干燥处。CaCl₂ 和葡萄糖的粉末混合物建议现用现配，以防止吸潮结块。
2. 用手术刀做一切口，再用锋利的梅奥剪刀沿赤道平面剪开眼球，直至将眼球分为前半部和后半部。使用标准型号的镊子尽可能去除眼球后半部的玻璃体。
   注意：将眼球分为两半有助于轻松分离短后睫状动脉（sPCA），避免解剖皿中眼球移动。但此步骤并非必需，也可不切开眼球而直接分离血管。
3. 使用解剖针将眼球后半部固定，使视网膜面朝下，视神经朝上面对实验操作者。
4. 用学生型 Vannas 弹簧剪刀轻轻剪除视神经周围的结缔组织，以暴露其下方的球后血管系统。
5. 短后睫状动脉（sPCA）可见为数条短小的血管分支（通常为 5–8 条），穿入巩膜并环绕视神经乳头呈环状分布（图 1C）。使用 5 号精密镊子和 Vannas 囊膜剪，连同周围结缔组织一起分离视神经旁和远端的 sPCA（图 1D）。
   注意：在整个分离过程中，务必保持 K-H 缓冲液处于冰冻状态。建议每 20–30 分钟更换一次缓冲液，具体频率可根据室温调整。

2. 样品制备

1. 在体视显微镜下，使用超细尖5号精密镊子和Vannas囊膜剪轻轻去除动脉段上的结缔组织，并用预冷的PBS冲洗分离的动脉，以去除污染物和血液残留物。
   注意： 如果样品不能立即进行后续步骤，需在液氮中速冻，并于-80 °C保存，直至进一步使用。

结果

图1：猪眼的代表性照片。

（A）眼球的侧面观显示位于眼部前段的角膜、巩膜、周围肌肉和视神经。（B）眼球后视图显示视神经。（C）在眼球后部可见sPCA的分支，包括视神经旁支和远端分支。（D）分离出的sPCA及其周围的脂肪和结缔组织。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二水合氯化钙 (CaCl<sub>2</sub>)	Carl Roth&nbsp;	5239.1	2.5 mM
杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (PBS)	Thermo Fisher Scientific&nbsp;	14190169
氯化钠 (NaCl)&nbsp;	Carl Roth	9265.2	118.3 mM
碳酸氢钠 (NaHCO<sub>3</sub>)	Carl Roth&nbsp;	965.3	25 mM
&alpha;-(D)-(+)-一水葡萄糖&nbsp;	Carl Roth&nbsp;	6780.1	11 mM
一次性手术刀 #21&nbsp;	pfm Medical&nbsp;	200130021
解剖针&nbsp;	Carl Roth&nbsp;	PK47.1
超精细邦剪刀（Bonn Scissors）&nbsp;	Fine Science Tools&nbsp;	14084-08
Falcon 圆锥形离心管 (50 mL)	Fisher Scientific&nbsp;	14-432-22
梅奥剪刀，耐切割型&nbsp;	Fine Science Tools&nbsp;	14130-17
精密镊子	&nbsp;Fine Science Tools&nbsp;	11251-10&nbsp;	5型
直头超精细尖端精密镊子	Carl Roth&nbsp;	LH53.1&nbsp;	5型
标准型持针钳	&nbsp;Fine Science Tools&nbsp;	11000-12
学生型Vannas弹簧剪&nbsp;	Fine Science Tools&nbsp;	91501-09
Vannas囊膜切开剪&nbsp;	Geuder&nbsp;	19760	&nbsp;直头，77 mm