使用冷冻麦管进行兔胚胎玻璃化冷冻：一种用于兔胚胎长期保存的超快速冷却技术

摘要

来源：Garcia-Dominguez, X. 等 兔模型中最佳胚胎阶段的微创胚胎移植与胚胎玻璃化冷冻技术。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们介绍了利用乙二醇和二甲基亚砜作为冷冻保护剂，以冷冻 straw 为载体系统，对收获的兔胚胎在目标发育阶段进行玻璃化冷冻的实验步骤。经玻璃化冷冻的胚胎具有较高的存活率，并可长期保存以备后续使用。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 胚胎玻璃化冷冻

1. 所有操作均在室温（约 22 °C）下进行，以降低在较高温度下玻璃化溶液的毒性。
   注意：本方案中可使用 0.1–2 µL 的自动移液器转移胚胎，但其他能够带动最小体积液体以移动胚胎的类似装置也可适用。
2. 采用两步添加法对胚胎进行玻璃化：
   1. 将胚胎置于平衡液中 2 分钟，平衡液成分为 10%（v/v）乙二醇和 10%（v/v）二甲基亚砜溶于基础培养基（BM）中。（BM 的组成：添加 0.2%（w/v）牛血清白蛋白的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS））
   2. 将胚胎（来自 步骤 1.2.1）转移至玻璃化溶液中 1 分钟，玻璃化溶液成分为 20%（v/v）乙二醇和 20%（v/v）二甲基亚砜溶于 BM 中。
3. 将胚胎加载至一支 0.25 mL 塑料细管（含一端封闭并带有棉塞，另一端开放）中。该过程示意图见 图 1。
   1. 将 0.25 mL 细管的封闭端连接至合适的微量分配器（例如 Captroll III®）。
   2. 吸入 BM 至细管长度的 1/3 处，随后吸入一小段空气泡。
   3. 吸入含有胚胎的 40 µL 玻璃化溶液，再吸入另一小段空气泡。
   4. 继续吸入 BM，直至第一段液体（步骤 1.3.2）到达棉塞处。
   5. 用细管塞封闭开放端。
4. 在执行 步骤 1.3 的同时进行 步骤 1.2.2，以确保时间间隔不超过 1 分钟，避免对胚胎产生毒性。
5. 将细管直接浸入液氮中，实现玻璃化。
6. 将细管存放于液氮杜瓦瓶中，保存所需时间。

结果

图1：正确装载的细管示意图。A) BM 指玻璃化冷冻过程中用于胚胎操作的培养基。胚胎必须在玻璃化溶液中进行装载。B) 装载后细管的宏观外观，以及胚胎位置的放大细节。这种大容量装置使我们能够对大量胚胎进行玻璃化冷冻，而不同于最小体积装置。此外，与最小体积装置相比，该装置的操作更为简便。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白（BSA）	VWR	332
二甲基亚砜	Sigma Aldrich	W387509
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	Sigma Aldrich	D5773	不含氯化钙。
乙二醇	Sigma Aldrich	102466-M
液氮	Air Liquide	P1505XXX
0.25 mL 塑料细管	IMV - technologies	6431
体视显微镜	Leica	MZ16F	也有更经济的选择，例如 Leica MZ8 或 Nikon SMZ-10 或 SMZ-2B，仅举几例。
细管封口塞	IMV - technologies	6431