兔胚胎移植：一种腹腔镜引导下将胚胎移植至排卵期受体雌性兔输卵管的实验操作流程

摘要

来源：Garcia-Dominguez, X. 等，在兔模型中最佳胚胎阶段进行微创胚胎移植与胚胎玻璃化冷冻。 J. Vis. Exp. (2019)

本视频介绍了通过腹腔镜将胚胎移植到受体雌性兔输卵管的技术。该技术可使胚胎在通过输卵管迁移过程中进行重塑，最终有助于成功着床。该技术也可高效用于保存的胚胎。

方案

1. 胚胎移植

1. 受体雌性动物的准备
   1. 仅使用性成熟的雌性个体（> 4.5 个月大。
   2. 移植前一周，将雌性动物置于16小时光照/8小时黑暗的环境中，以促进卵泡生长并提高雌性接受性。
   3. 选择受体雌性，观察其阴户的肿胀程度和颜色。若阴户肿胀且呈红润色，则该雌性处于可接受交配状态。
   4. 通过单次肌肉注射1 µg 醋酸布舍瑞林（促性腺激素释放激素的合成类似物），无需考虑体重，以诱导假孕（排卵）。
      注意：通常，对于中等体型的兔子（4-5 kg），0.8 µg 是适合的促排卵剂量，因此 1 µg 通常可确保排卵发生。
   5. 根据拟移植胚胎的年龄提前相应天数诱导排卵（例如，新鲜桑葚胚移植前70-72小时）。
2. 麻醉与镇痛
   1. 称重兔子，并准备以下麻醉剂和镇痛剂。
      1. 在1 mL注射器中装入赛拉嗪（5 mg/kg）和盐酸丁丙诺啡（0.03 mg/kg），配30G针头。在另一支1 mL注射器中装入盐酸氯胺酮（35 mg/kg），配23G颅周针头。
   2. 固定兔子，将赛拉嗪-布托啡诺混合物进行肌肉注射。
   3. 将含有氯胺酮的经颅针插入耳缘静脉，缓慢地将注射器内全部药液经静脉注入。
   4. 固定针头，并在后续步骤中保持其插入状态，以便必要时追加麻醉。
   5. 将兔子留在笼中（笼子需清洁且无其他动物），置于温暖的平台上。
   6. 失去意识后，涂抹眼膏以防止眼睛干涩，并检查是否缺失眼睑反射。
      注意： 该方案提供的手术麻醉平面至少可持续30分钟。若需延长麻醉时间，可在30分钟后追加注射盐酸氯胺酮，剂量为1.2.1中所述剂量的一半。
   7. 通过检查足底反射和呼吸运动来监测麻醉深度。呼吸模式变为不规则且频率加快，提示已失去适当的麻醉平面。
   8. 观察黏膜（眼睛、嘴唇）的颜色 等等。），呼吸频率（30-60 次/分钟）、心率（120-325 次/分钟）和直肠温度（38-39.6 °C）。
   9. 移植前8小时，停止给动物喂食，以避免肠道体积增大和活动增强，直至胚胎移植（ET）过程结束。可自由饮水。
3. 胚胎制备
   1. 将胚胎操作培养基预热至 25 °C：基础培养基（BM），由添加了 0.2%（w/v）牛血清白蛋白的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）组成。
   2. 在体视显微镜下，用 BM 缓冲液冲洗新鲜或已解冻（步骤 2）的胚胎。
   3. 使用无菌手套，将适当配置的17G硬膜外导管连接至1 mL注射器。
   4. 吸取1 cm的骨髓至导管内，随后吸入一小段空气。
   5. 吸取5-7个胚胎，体积为10 µL的BM，随后加入另一小段气泡。
   6. 通过抽吸1 cm骨髓完成导管的装载。
4. 胚胎移植
   1. 考虑使用无菌手套、无菌衣和口罩，以确保无菌环境。
   2. 对手术器械进行灭菌，清洁手术操作表面，并用70%乙醇擦拭。
   3. 按照之前所述方法（步骤1.2）实施麻醉，并检查反射是否消失。
   4. 用电剃刀剃除腹部腹侧的毛发。
   5. 无菌条件下准备腹部腹侧区域。
      1. 清洁手术区域并去除残留毛发。用葡萄糖酸氯己定皂液清洗手术区域。用氯己定溶液和96º乙醇对区域进行消毒（3次）。
   6. 将动物置于温暖的手术台上，呈头低45°的特伦德伦堡位（Trendelenburg's position），以确保胃和肠管位于颅侧。若膀胱充盈，应考虑排空膀胱。操作过程中若损伤任何内脏器官，可能导致动物死亡，因此必须确保内脏位置妥当（图1).
   7. 使用无菌毛巾覆盖该区域，毛巾中央开孔（开窗）暴露已剃毛的区域，以将手术部位与可能的污染区域隔离开。
   8. 将一个内镜套管针插入腹腔，位置位于剑突下方2 cm处，插入深度为5 cm，并通过该套管针使用压力调节型机械气腹机向腹膜腔内充气。
      注意： 腹腔内压力应维持在8-12 mmHg，使用CO₂₂ (图1A).
   9. 将内窥镜摄像头插入内窥镜套管中（图1B).
      注意：在胚胎移植前，识别生殖道，确定壶腹部和漏斗部的位置与状态，以利于后续操作。
   10. 将17-G硬膜外针插入漏斗部下方2-3 cm处的腹股沟区域（图1B).
   11. 确定漏斗部的入口（图2A，2B).
   12. 将已装载的导管（步骤1.3）经硬膜外穿刺针插入腹部（图1C).
   13. 找到输卵管，将硬膜外导管插入漏斗部至壶腹部，插入深度为1-2 cm（图2A-2C不要深入输卵管，以免造成损伤和出血。
   14. 通过轻轻按压连接到导管的注射器活塞，将胚胎释放到输卵管中（图2D-2F两个空气气泡都必须排出导管。
   15. 在胚胎释放后立即移除导管。
   16. 冲洗导管，通过抽吸和释放操作液来检查胚胎是否残留，并确认胚胎已成功移植。
   17. 如有需要，可在子宫的另一侧重复步骤 1.4.11 至 1.4.16。
   18. 移除硬膜外针和内窥镜摄像头。
   19. 释放 CO₂ 通过内窥镜套管。如果动物腹腔内残留过多气体，将引起疼痛和不适。
   20. 将内镜套管从腹腔中取出，移除手术巾。
   21. 停止麻醉。
   22. 用氯己定溶液清洁套管针切口。使用微粉化铝和塑料敷料闭合套管针切口。

结果

图1：腹腔镜辅助下的胚胎移植（外部视图）。 A) 内窥镜穿刺套管（单通道）的插入。 B) 内窥镜摄像头和硬膜外穿刺针的插入（黑色箭头）。 C) 胚胎移植导管经硬膜外穿刺针插入（白色箭头）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白（BSA） 	VWR	332
盐酸布托啡诺	Alvet Escartí 	626	须由持证兽医订购。
醋酸布舍瑞林	 Sigma Aldrich 	B3303
CO2 	Air Liquide 	99921	CO2 N48。
杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS）’  	Sigma Aldrich	D5773 	不含氯化钙
电动剃须刀 	 Oster Golden A5 	078005-140-002
内窥镜摄像机  	Optomic Spain S.A	OP-714
带硅胶瓣阀的内窥镜套管针  	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	30114GK 	轻型套管针型号。
氯己定葡萄糖酸盐皂液  	Alvet Escartí	0265DCCJ500B
23G颅外针	Alvet Escartí	514056353	 也可使用更小的针头。
硬膜外导管	 Vygon corporate	187.1
硬膜外针	 Vygon corporate	187.1
眼膏	 Alvet Escartí 	5273
腹腔镜设备 	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	 26003 AA 	Hopkins® 腹腔镜，0º直视型腹腔镜，30 cm 长，5 mm 工作通道。
光源  	Optomic Spain S.A	Fibrolux 250
机械式CO2气腹机 	 Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	Endoflator®
用于气腹机的硅胶管	r Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	20400040
体视显微镜	 Leica 	MZ16F 	也有更便宜的选择，例如 Leica MZ8 或 Nikon SMZ-10 或 SMZ-2B 等。
家兔  	瓦伦西亚理工大学ècnica de València 	品系A	也可使用其他母系，例如品系V或品系HP。