体外短发夹RNA介导的iHSPCs基因敲低：基于慢病毒的shRNA表达系统递送用于iHSPCs中特定基因表达的敲低

摘要

来源：Hsiao, Y. L., 等 通过短发夹RNA介导的基因沉默在造血干细胞与祖细胞系中研究树突状细胞发育 体外 J. Vis. Exp. (2022).

在本视频中，我们演示一种方法，通过将 shRNA 慢病毒载体转导至永生化造血干细胞和祖细胞（iHSPCs）中，以获得稳定的基因敲低细胞系。

方案

1. 永生化造血干细胞和祖细胞系（iHSPCs）的制备

1. 在含有 100 ng/mL FL 和 1 μM β-estradiol 的完全 RPMI 1640 培养基中培养 iHSPC 细胞系。
2. 每 3 天以 1:10 的比例传代细胞。
   注意：通过添加 10% 胎牛血清（FBS）、5 × 10^-5 M β-巯基乙醇和 10 μg/mL 庆大霉素配制完全 RPMI 1640 培养基。重组小鼠 FL 也可从商业途径获得。

2. 慢病毒转导

1. 将iHSPCs以1 × 10⁵ 个细胞/孔的密度接种于12孔板中，每孔加入含100 ng/mL FL、1 μM β-雌二醇和8 μg/mL polybrene的1 mL完全培养基。
   注意：polybrene的浓度取决于细胞类型，通常在4–8 μg/mL范围内。
2. 在每孔中加入携带shRNA的慢病毒，感染复数（MOI）为100。
   注意：慢病毒载体为带有嘌呤霉素筛选标记的pLKO.1-Puro（图1）。针对LacZ、Tcf4和Id2的shRNA靶序列分别列于

结果

图 1：慢病毒载体 pLKO.1-Puro 的构建图谱。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管 	ExtraGene 	TUBE-170-C
12孔组织培养处理板 	Falcon 	353043
胎牛血清（FBS） 	Corning 	35-010-CV
RPMI 1640 培养基 	Gibco 	11875-085
β-雌二醇  	Sigma-Aldrich	E2758-250MG
β-巯基乙醇（β-ME） 	Sigma-Aldrich 	M6250
Flt3 配体（FL） 	自制
聚凝胺（Polybrene） 	Sigma-Aldrich 	TR-1003-G
嘌呤霉素（Puromycin） 	Invivogen 	ant-pr-1
shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)	RNA干扰联合体（TRC）
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)	RNA干扰联合体（TRC）
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)	RNA干扰联合体（TRC）