一体化CRISPR基因组编辑：利用CRISPR-Cas9系统在培养细胞中基于同源定向修复的基因敲入方法 关键词：CRISPR-Cas9，基因敲入，同源定向修复，培养细胞，基因组编辑

摘要

来源：Zhang, L. 等，利用 CRISPR/Cas9 和细胞分选在巨噬细胞和 T 细胞系中实现基因敲入。J. Vis. Exp. (2021)。

在本视频中，我们展示了在培养细胞中使用一体化 CRISPR-Cas9 系统进行基因组编辑的方法，其中 Cas9 和 sgRNA 以单一质粒构建体的形式递送至细胞。通过电穿孔技术将 CRISPR-Cas9 系统及目的插入基因导入细胞，以实现高效的基因编辑。

方案

1. 巨噬细胞和T细胞系的电穿孔

1. 为电穿孔制备细胞培养物
   1. 制备添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基，作为Jurkat T细胞的完全生长培养基。制备添加10% FBS的DMEM培养基，用于RAW264.7巨噬细胞的培养。除用于转染后分选前孵育的培养基外，所有完全生长培养基均需补充100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素（Pen/Strep）。
   2. 根据供应商的说明对 RAW264.7 和 Jurkat T 细胞进行传代培养（参见 材料列表传代培养RAW264.7细胞时，使用0.25%的胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞。使用含10%（v/v）DMSO的FBS作为RAW264.7细胞和Jurkat细胞的冻存培养基。
   3. 以 250 × g 离心 5 分钟收集 RAW264.7 巨噬细胞，或以 90 × g 离心 8 分钟收集 Jurkat T 细胞。随后用 5–10 mL 1× DPBS（不含 Ca²⁺ 或 Mg²⁺ 离子）。移除 DPBS。
   4. 用2 mL的1× DPBS重悬细胞沉淀。取10 µL细胞悬液，与等体积的0.2%台盼蓝混合，用于估算细胞数量和细胞活力。
      注意： 确保细胞培养物具有 >转染当天细胞存活率为90%。
   5. 单次基因敲入实验中，使用10 µL核转染枪头进行电穿孔，重复五次。根据2.0 × 106个细胞的数量计算所需体积，并通过离心收集细胞。按照步骤1.1.2所述，用1× DPBS再次洗涤细胞沉淀。
      注意： 使用10 µL核转染枪头时，4.0 × 10⁵ 每次电穿孔需要的细胞数量。因此，至少准备 2.0 × 10⁶ 个细胞。⁶ 一次敲入实验所需的细胞。
   6. 在24孔板中每孔加入0.5 mL完全培养基（按步骤1.1.1配制），不添加青霉素/链霉素（Pen/Strep），于37 °C培养箱中预热。

2. CRISPR/Cas9 组分和靶向载体的电穿孔

1. 启动电穿孔系统。采用以下优化的电穿孔参数：RAW264.7 巨噬细胞为 1,400 V/20 ms/2 次脉冲，Jurkat T 细胞为 1350 V/20 ms/2 次脉冲。
2. 考虑到移液过程中的样品损失，在无菌的 1.5 mL 微离心管中配制 55 µL 电穿孔混合液，其中包含每种 CRISPR/Cas9 载体 2.5 µg（用于 mRosa26 位点敲入的 pDsR-mR26-sg1 和 pDsR-mR26-sg2，以及用于 hROSA26 位点的 pDsR-hR26-sg1 和 pDsR-hR26-sg2），2.4 µg 线性化靶向载体（用于 mRosa26 和 hROSA26 敲入的 pKR26-POI-iBFP 或 pKhR26-POI-iBFP，用 EcoRI 或 BamHI 线性化），以及重悬缓冲液 R。
   注意：为节省时间，可在离心过程中（步骤 1.1.5）提前配制电穿孔混合液。
3. 将步骤 1.1.5 中制备的 2.0 × 10⁶ 个细胞重悬于步骤 1.2.2 中的 55 µL 电穿孔混合液中。
4. 使用移液器和 10 µL 核转染吸头吸取步骤 1.2.3 中的细胞/电穿孔混合液。
   注意：移液过程中应避免引入气泡，否则可能导致电穿孔失败。
5. 将样品加入含有 3 mL 电穿孔试剂盒 Buffer E 的离心管中。
6. 按照步骤 1.2.1 中所述，对两种细胞类型分别应用相应的电穿孔参数。
7. 将样品转移至已预热培养基的 24 孔板中的一个孔内（培养基来自步骤 1.1.6）。
8. 对另外四个重复样本，以及仅含靶向载体和仅含 CRISPR 表达载体的对照组，重复执行步骤 1.2.4–1.2.7。
   注意：更换不同细胞类型或质粒 DNA 时，需更换核转染吸头和离心管。
9. 将转染后的细胞培养 48–72 小时，以使细胞在电穿孔后恢复，并表达 CRISPR/Cas9 组分，随后进行流式细胞术分析或荧光激活细胞分选（FACS）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨苄青霉素钠盐	MP Biomedicals	194526
Cellometer Mini 自动细胞计数仪	Nexcelom Bioscience
不含钙、镁的磷酸盐缓冲液（10X）	ThermoFisher Scientific	14200075
高糖改良杜尔贝科氏必需培养基（DMEM）	HyClone	SH30022.01
Falcon 5 ml 聚苯乙烯圆底试管	BD Biosciences	352003
胎牛血清（FBS）	ThermoFisher Scientific	10099141
Jurkat	ATCC	TIB-152	https://www.atcc.org/
硫酸卡那霉素	MP Biomedicals	194531
多通道移液器（30–300 μL）	Eppendorf 或同类产品
Neon 转染系统	ThermoFisher Scientific	MPK5000
Neon 转染系统 10 μL 套件	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Nunc 15 mL 圆锥形无菌离心管	ThermoFisher Scientific	339651
移液器吸头 0.1–20 µL	Eppendorf 或同类产品	0030 075.005
移液器吸头 2–200 µL	Eppendorf 或同类产品	0030 075.021
移液器吸头 50–1000 µL	Eppendorf 或同类产品	0030 075.064
pX458-DsRed2	Addgene	112219
RAW264.7	ATCC	TIB-71	https://www.atcc.org/
RPMI 1640 培养基	HyClone	SH30027.01
青霉素-链霉素双抗溶液	ThermoFisher Scientific	15140122
台盼蓝溶液，0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
1.5 mL PCR 级洁净微量离心管	Eppendorf 或同类产品	0030 125.215
24 孔透明 TC 处理多孔板	Corning	3524