基于锌指核酸酶的基因组编辑：利用双链同源依赖性修复机制在人类多能干细胞中修饰基因组的技术

摘要

来源：Blair, J. D., 等. 基因组编辑人类多能干细胞系的建立：从靶向到分离. J. Vis. Exp. (2016).

本视频展示了一种基于锌指核酸酶的人类多能干细胞（hPSCs）基因组编辑技术。由于hPSCs具有分化为多种细胞类型的潜力，该技术有助于以患者特异性的方式开展体外病理学和药理学研究。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 准备用于编辑的干细胞

1. 在含有 2.4 × 10 的 6 孔板中培养人多能干细胞（hPSCs）⁶ 细胞/孔，接种于明胶包被的丝裂霉素C失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上。每孔加入3 ml人胚胎干细胞培养基（hESC培养基），在37 °C、3% O₂的培养箱中培养人多能干细胞（hPSCs）₂/5% CO₂₂.
   注意： 对于本实验方案的成功而言，无需将人多能干细胞（hPSCs）维持在低氧培养箱中；但需要注意的是，hPSCs 在高氧环境中增殖速度更快₂ 环境不同，因此时间和细胞数量应相应调整。还应注意，处于低氧条件下培养的hPSCs自发分化率较低。
   1. 配制500 ml hESC培养基：将380 ml DMEM/F12、75 ml 胎牛血清（FBS）、25 ml KnockOut 血清替代物（KSR）混合。加入谷氨酰胺（终浓度1 mM）、5 ml 100×非必需氨基酸、青霉素-链霉素（P/S，终浓度100 units/ml）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，终浓度4 ng/ml）和2-巯基乙醇（终浓度5.5 µM）。
2. 使用玻璃移液管和真空装置吸除全部培养基（3 ml），然后用血清移液管加入3 ml预热的hESC培养基。每天更换培养基一次，直至hPSCs汇合度达到约50%（第-1天）。
3. 靶向操作前一天（第-1天），更换hESC培养基，弃去旧培养基，加入含有10 µM Y-27632的预温hESC培养基。
4. 同样在第 -1 天，从 DR4 小鼠制备一至两块含药物抗性 MEF 饲养层细胞的 6 孔或 10 cm 培养板（2.4 × 10⁶ 细胞/孔
   注意：通常情况下，6孔板比10 cm培养皿更具优势，因其可容纳更多培养基。6孔板还能确保不同孔中的克隆彼此独立。然而，具体选择取决于可用于挑取操作的显微镜类型，10 cm培养皿可能更便于挑取克隆。

2. 编辑多能干细胞

1. 用移液器将各5 µg的ZFN 1和ZFN 2（图1）加入1.5 ml离心管中，配制转染溶液。再向该管中加入30 µg修复质粒。最后加入1×磷酸盐缓冲液（PBS），使总体积达到300 µl。
   注意：质粒应采用中量提取试剂盒（任何品牌均可）制备，浓度至少为300 ng/µl，以确保转染溶液总体积不超过300 µl。无需进行酚/氯仿抽提、质粒线性化，或使用无内毒素质粒提取试剂盒。
2. 使用玻璃移液管和真空泵吸除hPSCs培养孔中的培养基。每孔加入2 ml预热的1× PBS洗涤细胞。
3. 立即用玻璃移液管和真空泵吸除PBS。每孔直接加入0.5 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。将培养板置于培养箱（37 °C/5% CO₂/3% O₂）中孵育约10分钟，或直至饲养层细胞开始从培养皿脱离。
4. 每孔加入2 ml预热的esWash培养基（470 ml DMEM/F12，25 ml FBS，100 单位/ml 青霉素/链霉素）以终止胰蛋白酶反应。
5. 确保饲养层细胞以片状脱落。将每孔内容物转移至同一个50 ml锥形离心管中，合并所有孔的细胞悬液。使用10 ml血清移液管轻轻吹打混匀细胞。无需将饲养层细胞完全打散；通过轻柔吹打即可使hPSCs从饲养层上脱落。最终细胞悬液体积约为15 ml。
6. 向离心管中加入25 ml esWash培养基，使总体积达到40 ml。静置1–2分钟，使较大的饲养层细胞团块沉降至管底。用血清移液管小心吸除上清液（约38 ml），转移至新的50 ml锥形离心管中。
7. 在190 × g条件下离心5分钟。使用玻璃移液管和真空泵吸除上清液，注意勿扰动细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于500 µl 1× PBS中，并与先前配制的质粒转染溶液混合。在此步骤进行细胞计数。每轮电穿孔使用500万至1000万个细胞。
8. 将全部800 µl细胞悬液转移至4 mm电穿孔杯中，置于冰上孵育3–5分钟。使用电穿孔仪的指数衰减程序进行电穿孔，参数设置如下：250 V，500 µF，∞电阻，4 mm电穿孔杯。电穿孔完成后，将电穿孔杯重新放回冰上孵育3分钟。
   注意：观察电穿孔仪上显示的时间常数。时间常数随细胞数量和DNA纯度而变化。在使用上述条件及Gene Pulser II仪器时，成功转染的时间常数通常介于10–14毫秒之间。若时间常数偏离此范围，可能导致电穿孔效率降低。
9. 将电穿孔后的细胞重悬于18 ml预热的hESC培养基中，该培养基需添加10 µM Y-27632。将3 ml单细胞悬液接种至含DR4饲养层细胞的6孔板的每个孔中。将培养板放回培养箱（37 °C/5% CO₂/3% O₂）中继续培养。

3. 阳性克隆的筛选

1. 第2天，使用玻璃移液管和真空装置移除所有培养基。加入3 ml添加了10 µM Y-27632的预温hESC培养基。第3天，使用玻璃移液管和真空装置移除所有培养基。更换为3 ml不含Y-27632的预温hESC培养基。第4天，使用玻璃移液管和真空装置移除所有培养基。加入3 ml添加了抗生素用于筛选的预温hESC培养基。放回培养箱（37 °C/5% CO₂/3% O₂）。
   注意：所使用的抗生素类型取决于修复模板中包含的抗性表达盒。在使用WIBR#3 hPSCs（NIH注册号0079）时，已成功使用0.5 µg/ml嘌呤霉素、70 µg/ml G418（遗传霉素）和35 µg/ml潮霉素。筛选所需的抗生素浓度应通过实验确定，即确定在约一周内能够杀死野生型细胞的最低抗生素浓度。
2. 第5至12天，每天更换培养基，每次均用添加了抗生素的预温hESC培养基替换旧培养基。
   注意：预计会出现大量细胞死亡。单个克隆大约在第8至10天开始显现。连续筛选12至14天后，可改用不含抗生素的常规hESC培养基。如果细胞密度较高或细胞死亡较慢，应避免培养基酸化，在筛选的最初几天可能需要增加培养基体积（至多4–5 ml）。

结果

图1. 使用AAV-CAGGS-EGFP修复模板对AAVS1位点进行基因编辑的示意图。 修改自 Hockemeyer 等，2009年。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12	Life Technologies	11320082
胎牛血清（HI）	Life Technologies	10082-147
无血清培养基（Knockout Serum）	Life Technologies	10828-028
碱性成纤维细胞生长因子	Life Technologies	PHG0261
青霉素-链霉素（Pen/Strep）	Life Technologies	15140-122
谷氨酰胺	Life Technologies	25030-081
MEM 非必需氨基酸（MEM NEAA）	Life Technologies	11140-050
2-巯基乙醇	Life Technologies	21985-023
Y-27632	Calbiochem	688000
6 孔板	Corning	3506
4 mm 电穿孔比色皿	Bio-rad	165-2081
X-cel 基因脉冲仪 II	Bio-rad	165-2661
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	25200-056
10× 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4	Life Technologies	70011-044
嘌呤霉素	Life Technologies	A11138-02