基于锌指核酸酶的基因组编辑:一种通过双链同源依赖性修复机制修饰人类多能干细胞基因组的技术

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 准备用于编辑的干细胞

1. 在含有 2.4 ×^{10 6} 个细胞/板的丝裂霉素 C 灭活小鼠胚胎成纤维细胞 （MEF） 饲养层的 6 孔板上生长和培养人多能干细胞 （hPSC）。将 hPSC 维持在每孔 3 ml 人胚胎干细胞培养基（hESC 培养基）中，并在 37 °C 培养箱中生长，含 3% O₂/5% CO₂.
   注意:为了该方案的成功，没有必要将 hPSC 维持在低氧培养箱中;然而，需要注意的是，hPSC 在高 O₂ 环境中增殖得更快，因此应相应地调整时间和细胞数量。还应注意的是，维持在低氧状态的 hPSC 具有较低的自发分化率。
   1. 要制备 500 ml hESC 培养基，请将 380 ml DMEM/F12、75 ml 胎牛血清 （FBS）、25 ml KnockOut 血清替代物 （KSR） 混合。加入谷氨酰胺（1 mM 终浓度）、5 ml 100x 非必需氨基酸、100 单位/ml 青霉素-链霉素 （P/S）、碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）（终浓度 4 ng/ml）和 2-巯基乙醇（终浓度 5.5 μM）。
2. 使用玻璃移液管并抽真空去除整个体积的培养基 （3 ml） 来更换培养基。使用血清移液管更换为 3 ml 温热的 hESC 培养基。每天重复更换培养基，直到 hPSC 达到大约 50% 汇合（第 1 天）。
3. 靶向前一天（第 1 天），更换 hESC 培养基，去除旧培养基并加入补充有 10 μM Y-27632 的温热 hESC 培养基。
4. 同样在第 -1 天，准备一到两个来自 DR4 小鼠的耐药 MEF 饲养细胞板（2.4 × 10⁶ 个细胞/板><）。 注意:一般来说，6 孔板比 10 cm 板更有利，因为它们可容纳更多介质。6 孔板还可以确保来自不同孔的不同克隆是独立的。然而，10 cm 的板将更容易拾取，具体取决于可用于此过程的显微镜。

2. 编辑多能干细胞

1. 通过将 5 μg ZFN 1 和 2（图 1）移液到 1.5 ml 试管中来制备转染溶液。将 30 μg 修复质粒也移液到该管中。最后，将 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 移液到试管中，使体积达到 300 μl
   注意:制备质粒作为中量提取（任何试剂盒都适用），最低浓度为 300 ng/μl，以将转染溶液的总体积保持在 300 μl 以下。无需进行苯酚/氯仿提取、质粒线性化或使用无内毒素质粒制备试剂盒。
2. 使用玻璃移液管从 hPSC 中取出培养基并抽真空。将 2 ml 温热的 1x PBS 移液到每个孔中以洗涤细胞。
3. 立即使用玻璃移液管除出 PBS 并抽真空。将 0.5 ml 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液直接添加到每个孔中的细胞中。放入培养箱 （37 °C/5% CO₂/3% O₂） 中约 10 分钟，或直到饲养层开始从培养板上掀起。
4. 向每个孔中加入 2 ml 温热的 esWash 培养基（470 ml DMEM/F12、25 ml FBS、100 单位/ml P/S）以终止胰蛋白酶反应。
5. 确保饲养层电池以片状脱落。将每个孔的内容物移液到单个 50 ml 锥形管中，合并所有孔。使用 10 ml 血清移液管研磨细胞。没有必要打破馈线层;hPSC 将通过温和研磨从饲养层脱落。应该有大约 15 ml 的细胞悬液。
6. 向试管中加入 25 ml esWash 培养基，使总体积达到 40 ml。让大饲养块在试管底部沉淀 1-2 分钟。使用血清移液管从试管中取出上清液 （~38 ml），并沉积到新的 50 ml 锥形管中。
7. 以 190 x g 的速度旋转 5 分钟。使用玻璃移液管从试管中取出上清液并抽真空。确保不要干扰细胞沉淀。将细胞重悬于 500 μl 1x PBS 中。与较早制备的质粒转染溶液混合。在此步骤中对细胞进行计数。每次电穿孔使用 5-1000 万个细胞。
8. 将整个 800 μl 悬浮液移液到 4 mm 电穿孔比色皿中，置于冰上 3-5 分钟。使用电穿孔系统上的指数程序对细胞进行电穿孔，参数如下:250 V、500 μF、∞电阻和 4 mm 比色皿尺寸。电穿孔后，将比色皿放回冰上 3 分钟
   注意:观察电穿孔系统上电穿孔的时间常数。时间常数随细胞数量和 DNA 纯度而变化。当使用所列条件和基因脉冲器 II 时，成功的转染通常具有 10-14 毫秒的时间常数。当时间常数与这些值不同时，电穿孔效率会降低。
将
9. 电穿孔细胞重悬于补充有 10 μM Y-27632 的 18 ml 温热 hESC 培养基中。将 3 ml 这种单细胞悬液接种到含有 DR4 饲养层细胞的 6 孔板的每个孔中。返回培养箱（37 °C/5% CO₂/3% O₂）。

3. 阳性菌落的选择

1. 第 2 天，使用玻璃移液器除去所有培养基并抽真空。用 3 ml 补充有 10 μM Y-27632 的温热 hESC 培养基替换。第 3 天，使用玻璃移液管除去所有培养基并吸尘。更换为 3 ml 温热的 hESC 培养基，不包括 Y-27632。第 4 天，使用玻璃移液管去除所有培养基并抽真空。用 3 ml 补充有抗生素的温热 hESC 培养基替换以供选择。返回培养箱 （37 °C/5% CO₂/3% O₂）.
   注意:使用的抗生素类型将取决于修复模板中包含的耐药盒。当使用 WIBR#3 hPSC（NIH 登记处 0079）时，已成功使用 0.5 μg/ml 嘌呤霉素、70 μg/ml G418（遗传霉素）和 35 μg/ml 潮霉素。选择浓度应通过确定在大约一周内杀死野生型细胞所需的抗生素的最低浓度来凭经验确定。
2. 第 5-12 天，每天更换培养基，每次用补充抗生素的温热 hESC 培养基替换旧培养基><。 注意:预计会有大量细胞死亡。单个菌落将在第 8-10 天左右变得明显。连续选择 12-14 天后，可以使用不含抗生素的常规 hESC 培养基。如果细胞密度高或细胞死亡缓慢，则应避免培养基酸化，并且可能需要在选择的最初几天增加培养基体积（最多 4-5 ml）。

图 1.使用 AAV-CAGGS-EGFP 修复模板编辑的 AAVS1 基因座示意图。修改自 Hockemeyer 等人，2009 年。