基于锌指核酸酶的基因组编辑：利用双链同源依赖性修复机制在人类多能干细胞中修饰基因组的技术

摘要

来源：Blair, J. D., 等. 基因组编辑人类多能干细胞系的建立：从靶向到分离. J. Vis. Exp. (2016).

本视频展示了一种基于锌指核酸酶的人类多能干细胞（hPSCs）基因组编辑技术。由于hPSCs具有分化为多种细胞类型的潜力，该技术有助于以患者特异性的方式开展体外病理学和药理学研究。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 准备用于编辑的干细胞

1. 在含有 2.4 × 10 的 6 孔板中培养人多能干细胞（hPSCs）⁶ 细胞/孔，接种于明胶包被的丝裂霉素C失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上。每孔加入3 ml人胚胎干细胞培养基（hESC培养基），在37 °C、3% O₂的培养箱中培养人多能干细胞（hPSCs）₂/5% CO₂₂.
   注意： 对于本实验方案的成功而言，无需将人多能干细胞（hPSCs）维持在低氧培养箱中；但需要注意的是，hPSCs 在高氧环境中增殖速度更快₂ 环境不同，因此时间和细胞数量应相应调整。还应注意，处于低氧条件下培养的hPSCs自发分化率较低。
   1. 配制500 ml hESC培养基：将380 ml DMEM/F12、75 ml 胎牛血清（FBS）、25 ml KnockOut 血清替代物（KSR）混合。加入谷氨酰胺（终浓度1 mM）、5 ml 100×非必需氨基酸、青霉素-链霉素（P/S，终浓度100 units/ml）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，终浓度4 ng/ml）和2-巯基乙醇（终浓度5.5 µM）。
2. 使用....

结果

图1. 使用AAV-CAGGS-EGFP修复模板对AAVS1位点进行基因编辑的示意图。 修改自 Hockemeyer 等，2009年。

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12	Life Technologies	11320082
胎牛血清（HI）	Life Technologies	10082-147
无血清培养基（Knockout Serum）	Life Technologies	10828-028
碱性成纤维细胞生长因子	Life Technologies	PHG0261
青霉素-链霉素（Pen/Strep）	Life Technologies	15140-122
谷氨酰胺	Life Technologies	25030-081
MEM 非必需氨基酸（MEM NEAA）	Life Technologies	11140-050
2-巯基乙醇	Life Technologies	21985-023
Y-27632	Calbiochem	688000
6 孔板	Corning	3506
4 mm 电穿孔比色皿	Bio-rad	165-2081
X-cel 基因脉冲仪 II	Bio-rad	165-2661
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	25200-056
10× 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4	Life Technologies	70011-044
嘌呤霉素	Life Technologies	A11138-02