TALEN介导的靶向基因整合：利用工程化序列特异性核酸酶将荧光蛋白基因精确插入hiPSCs

摘要

来源：Cerbini, T. 等. 将携带GFP基因的TALEN靶向人诱导性多能干细胞并转染至AAVS1安全位点后的转染、筛选与克隆挑取。J. Vis. Exp. (2015)

本视频介绍了一种利用 TALEN 在人诱导性多能干细胞（hiPSCs）中进行精确基因组编辑的技术，该技术通过在特定基因位点产生双链断裂，诱导同源定向修复，从而实现荧光蛋白基因的整合。

方案

1. 基底膜基质的制备及塑料器皿的包被

1. 将来自 -20 °C 的冷冻基底膜基质储备液置于冰上，并在 4 °C 下过夜解冻。
2. 解冻后，用移液器将 2 mg 的基底膜基质分装至预冷的离心管中。保存于 -20 °C，待需要时使用。
3. 为制备包被基底膜基质的培养板，将一份分装样品置于冰上解冻，直至离心管中最后一块冰完全消失（通常在约 2 小时内）。
4. 解冻后，将基底膜基质加入 12 ml 冷的（4 °C）DMEM/F12 中，配制成基底膜基质包被溶液。
5. 将基底膜基质溶液加入适当的培养容器中。对于 6 孔板，每孔加入 1 ml。轻轻摇晃培养板，确保基底膜基质溶液完全覆盖每个孔。
6. 用封口膜密封包被好的基底膜基质培养板/培养皿，并在室温下孵育 1 小时后使用。或者，可将包被好的基底膜基质培养板/培养皿储存于 4 °C，并在包被后 2 周内使用。
   注意：向包被好的基底膜基质培养板/培养皿中额外添加 DMEM/F12，以防止干燥。使用储存在 4 °C 的包被板/培养皿前，将其放入生物安全柜中，使其恢复至室温至少 30 分钟。
7. 在加入培养基和细胞前，彻底吸除基底膜基质。

2. E8 培养基的制备

1. 通过在 4....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质，*无LDEV，10 ml	Corning	354230	在 -20 °C 下保存。
DMEM/F-12	Life Technologies	11320-033	在 4 °C 下保存。
Costar 6 孔透明 TC 处理多孔板	Corning	3506
Essential 8 培养基	Life Technologies	A1517001	基础培养基在 4 °C 下保存，补充剂在 -20 °C 下保存。
Y-27632 二盐酸盐	Tocris	1254	室温保存。溶解于 H2O 后，于 -20 °C 保存。
氯化钠	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0	Life Technologies	15575-020
不含钙、镁的 DPBS	Life Technologies	14190-250
100 mm TC 处理培养皿	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - 学术用途	GlobalStem	GSC-6204G	在液氮中保存。
DMEM，高糖，含丙酮酸	Life Technologies	11995-040	在 4 °C 下保存。
限定型胎牛血清，美国来源	HyClone	SH30070.03	在 -20 °C 下保存。在 4 °C 过夜解冻并分装。分装后于 -20 °C 保存，直至使用。
MEM 非必需氨基酸溶液（100X）	Life Technologies	11140-050	在 4 °C 下保存。
4D-Nucleofector 核心单元	Lonza	AAF-1001B	电穿孔系统的一部分。
4D-Nucleofector X 单元	Lonza	AAF-1001X	电穿孔系统的一部分。
P3 原代细胞 4D-Nucleofector X 试剂盒 L（24 次反应）	Lonza	V4XP-3024	收到后，取出原代细胞溶液和补充剂，并在 4 °C 下保存。
StemPro Accutase 细胞解离试剂	Life Technologies	A1110501	在 -20 °C 下保存。在 4 °C 过夜解冻，并在使用前将分装样品在 37 °C 水浴中预热。
NutriStem XF/FF 培养基	Stemgent	01-2005	在 -20 °C 下保存。在 4 °C 过夜解冻
AAVS1 TALENs（pZT-AAVS1-L1 和 pZT-AAVS1-R1）	Addgene	52637 和 52638
AAVS1-CAG-EGFP 同源重组供体质粒	Addgene	22212
嘌呤霉素二盐酸盐	Life Technologies	A11138-03	在 -20 °C 下保存。用 ddH2O 配制 1 mg/ml 的工作液分装保存。
一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR（带制冷），120 V 60 Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 × 750 ml 摆动桶转子	Thermo Scientific	75003607
台盼蓝溶液，0.4%	Life Technologies	15250-061