TALEN 介导的靶向基因整合:使用工程序列特异性核酸酶将荧光蛋白基因精确插入 hiPSC 中

Abstract

来源:Cerbini， T. et al.将 GFP 基因靶向的人诱导多能干细胞的转染、选择和集落挑选到 AAVS1 安全港中。J. Vis. Exp.（2015 年）

该视频介绍了一种在人诱导多能干细胞 （hiPSC） 中进行的精确基因组编辑技术，该技术使用 TALEN 在目标基因座处产生双链断裂，诱导荧光蛋白基因整合的同源定向修复。

Protocol

1. 基底膜基质的制备和塑料器皿的涂层

1. 将-20°C的冷冻基底膜基质原液放在冰上，并在4°C下解冻过夜。
2. 解冻后，将 2 mg 等分试样的基底膜基质移液到预冷的 eppendorf 管中。将它们储存在 -20 °C 直至需要。
3. 要制备基底膜基质包被板，请在冰上解冻一份等分试样，直到 eppendorf 管中的最后一块冰消失（通常在 ~2 小时内）。
4. 解冻后，将基底膜基质加入 12 ml 冷 （4 °C） DMEM/F12 中，制成基底膜基质包被溶液。
5. 将基底膜基质溶液添加到适当的培养容器中。对于 6 孔板，每孔分配 1 mL。旋转板以确保基底膜基质溶液完全覆盖每个孔。
6. 封口膜密封基底膜基质包被的板/培养皿，并在室温下孵育 1 小时后再使用。或者，将基底膜基质包被的板/培养皿储存在 4 °C 下，并在涂层后 2 周内使用><。 注意:将额外的 DMEM/F12 添加到基底膜基质包被的板/培养皿中以防止干燥。在使用4°C储存的基底膜基质包被板/培养皿之前，将其置于生物安全柜中，并使其达到室温至少30分钟。
7. 在加入培养基和细胞之前，完全吸出基底膜基质。

2. E8 培养基的制备

1. 通过在 4 °C 下解冻 E8 补充剂过夜来制备 E8 培养基。
2. 从 500 ml 原液中取出 10 ml E8 基础培养基并丢弃。
3. 将整个 10 ml 小瓶 E8 补充剂直接移液到 490 ml E8 基础培养基中。不要在 37 °C 水浴中加热完全 E8 培养基，因为反复的温度波动会降解完全 E8 培养基中的 bFGF。
4. 在添加补充剂后 2 周内使用完整的 E8 培养基。

3. iPSC 解冻

1. 从液氮中取出一小瓶冷冻 iPSC，放在干冰上。
2. 在 37 °C 水浴中快速解冻样品瓶;在水浴中旋转样品瓶，直到只剩下一小块冰。
3. 用 70% 乙醇喷洒小瓶并转移到生物安全柜中。
4. 将 1 ml 室温 E8 培养基直接滴加到小瓶中。
5. 使用 2 ml 移液器，将细胞悬液滴加到 15 ml 锥形管中的 9 ml E8 培养基中。经常旋转试管，以确保细胞和培养基快速混合。
6. 将细胞以 200 x g 离心 5 分钟。
7. 吸出上清液，将细胞沉淀重悬于适当体积的补充有 10 μM Y-27632 的 E8 中。
8. 将细胞加入适当数量的基底膜基质包被孔中，并置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中过夜。建议在 6 孔板的每个孔中至少接种 0.2 x 10⁶ iPSC，以便在解冻后快速恢复。

4. iPSC 的维护和常规传代

1. 每天刷新 E8 中号。
2. 用倒置显微镜监测细胞的形态和汇合度。高质量的 iPSC 在具有明显边界的平坦菌落中生长;单个菌落具有"鹅卵石状"外观。
3. 当 iPSCs 细胞达到 ~70% 汇合时传代。
4. 通过向 500 ml DPBS 中加入 0.9 g NaCl 和 500 μl 0.5 M EDTA 来制备 EDTA 传代溶液。充分混合以溶解 NaCl，并真空过滤以消毒。传代前，在 37 °C 水浴中加热等分试样的传代溶液。
5. 传代时，吸出用过的培养基，并用等体积的温传代溶液洗涤细胞一次。吸出并移液足够的 EDTA 传代溶液以包被细胞（6 孔板每孔 1 ml）。
6. 将细胞置于倒置显微镜下并观察 iPSC 集落。菌落内出现孔洞和凸起的边界应在 2 到 5 分钟内变得明显。
7. 小心吸出 EDTA 传代溶液。
8. 使用 10 ml 移液器，在高压下将 4 ml E8 培养基（如果使用 6 孔板）直接分配到每个待传代的孔中。
9. 收集 iPSC 团块，并根据 1:8 至 1:12 的分流比分成适当数量的孔。不要过度移液，因为细胞团块的解聚会导致活力不佳。
10. 将板放入培养箱中，来回和左右摇动板数次以分散细胞。

5. 用于转染的 MEF 和 iPSC 的制备

1. 转染前 48 小时，以 ~1:6 的比例将 iPSC 传代到基底膜基质包被的 6 孔板的四个或更多孔中，以便它们在两天后达到 70% 汇合。
2. 第二天，将 DR4 MEF 解冻到由补充有 10% FBS 和 1x MEM-NEAA 的 DMEM（高葡萄糖）组成的 MEF 培养基中。
3. 将 DR4 MEF 以 ~ 2 x 10⁴ 个细胞/cm² 的浓度接种到两个 10 cm 培养皿中，并在 37 °C 下孵育过夜。
4. 转染当天，在对 iPSC 进行转染前 30 分钟，将 MEF 培养基更换为添加 10 μM Y-27632 的 E8。
5. 可选:转染前 4 小时，用终浓度为 10 μM 的 Y-27632 补充转染前 iPSC 培养物。

6. 使用电穿孔系统对 iPSC 进行温和细胞解离试剂处理和转染

1. 从 4 °C 中取出 P3 原代细胞转染溶液，使其达到室温 ~30 分钟。使用前，将整个 100 μl 补充剂添加到转染溶液中。
2. 在 37 °C 水浴中加热温和细胞解离试剂。
3. 从 -20 °C 获得 AAVS1 TALENs（pZT-AAVS1-L1 和 pZT-AAVS1-R1）和 AAVS1-CAG-EGFP 供体。
4. 从培养箱中取出 iPSC 并用 DPBS 洗涤一次。
5. 每孔加入 1 ml 温和细胞解离试剂，并在 37 °C 下孵育 iPSC 5 分钟，或直到超过 50% 的细胞从培养容器中解离。
6. 使用 p1000 移液器上下移液细胞数次，以将任何剩余的细胞从培养容器中解离，并打碎 iPSC 团块。
7. 向每个孔中加入 2 ml E8 培养基，并使用 10 ml 移液管上下移液数次，以进一步将细胞团块分解成单个细胞><。 注意: 如果细胞团块没有充分解聚，转染效率会显著下降。
8. 在 15 ml 锥形管中收集 iPSC，并以 100 x g 离心 3 分钟。
9. 吸出上清液，并将细胞重悬于极少量的 E8 培养基中。
10. 在应用重要染色剂（如 0.4% 台盼蓝）后，使用血细胞计数器对细胞进行计数。确保细胞在计数时充分解离（每"团"1-3 个细胞）。
11. 将 3 x 10⁶ 细胞分配到两个 15 ml 锥形管中，然后再次以 100 x g 的速度离心 3 分钟
    注意: 低速离心可降低细胞应激，并允许在电穿孔前轻松重悬 iPSC。
12. 将电穿孔系统设置为人胚胎干细胞系 H9 的细胞类型特异性程序（程序 CB-150）。
13. 离心后，从细胞沉淀中吸出上清液。向一个沉淀中加入 10 μg HR 供体作为对照样品。向另一个沉淀中加入 10 μg HR 供体，以及 5 μg 每种 TALEN（pZT-AAVS1-L1 和 pZT-AAVS1-R1）作为实验样品。
14. 将每个细胞沉淀重悬于 100 μl P3 原代细胞转染溶液中，并转移到比色皿中。
15. 进行转染并立即向每个比色皿中加入 500 μl 室温 E8 培养基。
16. 将转染的 iPSC 逐滴转移到一个 10 cm 培养皿中，该培养皿含有步骤 5.4 中制备的 DR4 MEF。

Materials