TALEN介导的靶向基因整合：利用工程化序列特异性核酸酶将荧光蛋白基因精确插入hiPSCs

摘要

来源：Cerbini, T. 等. 将携带GFP基因的TALEN靶向人诱导性多能干细胞并转染至AAVS1安全位点后的转染、筛选与克隆挑取。J. Vis. Exp. (2015)

本视频介绍了一种利用 TALEN 在人诱导性多能干细胞（hiPSCs）中进行精确基因组编辑的技术，该技术通过在特定基因位点产生双链断裂，诱导同源定向修复，从而实现荧光蛋白基因的整合。

方案

1. 基底膜基质的制备及塑料器皿的包被

1. 将来自 -20 °C 的冷冻基底膜基质储备液置于冰上，并在 4 °C 下过夜解冻。
2. 解冻后，用移液器将 2 mg 的基底膜基质分装至预冷的离心管中。保存于 -20 °C，待需要时使用。
3. 为制备包被基底膜基质的培养板，将一份分装样品置于冰上解冻，直至离心管中最后一块冰完全消失（通常在约 2 小时内）。
4. 解冻后，将基底膜基质加入 12 ml 冷的（4 °C）DMEM/F12 中，配制成基底膜基质包被溶液。
5. 将基底膜基质溶液加入适当的培养容器中。对于 6 孔板，每孔加入 1 ml。轻轻摇晃培养板，确保基底膜基质溶液完全覆盖每个孔。
6. 用封口膜密封包被好的基底膜基质培养板/培养皿，并在室温下孵育 1 小时后使用。或者，可将包被好的基底膜基质培养板/培养皿储存于 4 °C，并在包被后 2 周内使用。
   注意：向包被好的基底膜基质培养板/培养皿中额外添加 DMEM/F12，以防止干燥。使用储存在 4 °C 的包被板/培养皿前，将其放入生物安全柜中，使其恢复至室温至少 30 分钟。
7. 在加入培养基和细胞前，彻底吸除基底膜基质。

2. E8 培养基的制备

1. 通过在 4 °C 下过夜解冻 E8 添加剂来制备 E8 培养基。
2. 从 500 ml 储存液中移除 10 ml E8 基础培养基并弃去。
3. 将整瓶 10 ml 的 E8 添加剂直接用移液管加入 490 ml 的 E8 基础培养基中。不要将完全配制的 E8 培养基置于 37 °C 水浴中预热，因为反复的温度变化会降解完全 E8 培养基中的 bFGF。
4. E8 添加剂加入后，完全配制的 E8 培养基须在 2 周内使用完毕。

3. iPSC 的解冻

1. 从液氮中取出一管冷冻的iPSCs，置于干冰上。
2. 将该管迅速放入37 °C水浴中解冻；在水浴中轻轻旋转管子，直至仅剩微小冰晶。
3. 用70%乙醇喷洒管体，并转移至生物安全柜中。
4. 以1 ml室温E8培养基逐滴直接加入管中。
5. 使用2 ml移液器将细胞悬液逐滴转移至含有9 ml E8培养基的15 ml锥形离心管中。转移过程中频繁轻柔旋转离心管，以确保细胞与培养基迅速充分混匀。
6. 在200 xg条件下离心5分钟。
7. 吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于适量含有10 μM Y-27632的E8培养基中。
8. 将细胞接种至适当数量的基底膜基质包被的培养孔中，置于37 °C、5% CO₂培养箱中过夜。建议每6孔板每孔接种至少0.2 x 10⁶个iPSC，以促进解冻后的快速恢复。

4. iPSC 的维持与常规传代

1. 每天更换 E8 培养基。
2. 使用倒置显微镜观察细胞形态和融合度。高质量的诱导多能干细胞（iPSC）以扁平、边界清晰的克隆形式生长；单个克隆呈现“鹅卵石样”外观。
3. 当 iPSC 细胞达到约 70% 融合度时进行传代。
4. 通过将 0.9 g NaCl 和 500 μl 0.5 M EDTA 加入 500 ml DPBS 中配制 EDTA 传代溶液。充分混匀以溶解 NaCl，并通过真空过滤灭菌。传代前将一份溶液置于 37 °C 水浴中预热。
5. 传代时，吸除用过的培养基，并用等体积的预热传代溶液洗涤细胞一次。吸除溶液后，加入足量 EDTA 传代溶液以覆盖细胞（每 6 孔板每孔 1 ml）。
6. 将细胞置于倒置显微镜下观察 iPSC 克隆。克隆内部出现孔洞及边缘翘起的现象应在 2 至 5 分钟内变得明显。
7. 小心吸除 EDTA 传代溶液。
8. 使用 10 ml 移液器，以较高压力将 4 ml E8 培养基（若使用 6 孔板）直接注入待传代的每个孔中。
9. 收集 iPSC 细胞团块，并根据 1:8 至 1:12 的传代比例将其分装至适当数量的孔中。避免过度吹打，以免细胞团块过度解离，导致细胞存活率降低。
10. 将培养板放入培养箱中，并前后左右轻轻摇晃数次，以使细胞均匀分布。

5. 转染用小鼠胚胎成纤维细胞和诱导多能干细胞的制备

1. 转染前48小时，将iPSC以约1:6的比例传代至经基底膜基质包被的6孔板中的四个或更多孔中，使其两天后达到70%融合度。
2. 次日，将DR4 MEF解冻并接种于MEF培养基中，该培养基由DMEM（高糖）添加10% FBS和1× MEM-NEAA组成。
3. 将DR4 MEF以约2 × 10⁴ cells/cm²的密度接种至两个10 cm培养皿中，并在37 °C下过夜培养。
4. 转染当天，在对iPSC进行转染操作前30分钟，将MEF培养基更换为添加了10 μM Y-27632的E8培养基。
5. 可选：转染前4小时，在转染前的iPSC培养物中加入Y-27632，终浓度为10 μM。

6. 使用电穿孔系统对iPSC进行温和细胞解离试剂处理和转染

1. 从4 °C取出P3原代细胞转染液，室温放置约30分钟使其恢复至室温。使用前将全部100 μl补充剂加入转染液中。
2. 将温和细胞解离试剂在37 °C水浴中预热。
3. 从-20 °C取出AAVS1 TALENs（pZT-AAVS1-L1和pZT-AAVS1-R1）以及AAVS1-CAG-EGFP供体质粒。
4. 将iPSCs从培养箱中取出，用DPBS洗涤一次。
5. 每孔加入1 ml温和细胞解离试剂，37 °C孵育5分钟，或直至超过50%的细胞从培养容器上解离。
6. 使用P1000移液器将细胞上下吹打数次，以使残留细胞从培养容器上完全解离，并打散iPSC细胞团块。
7. 每孔加入2 ml E8培养基，使用10 ml移液器上下吹打数次，进一步将细胞团块分散为单细胞。
   注意：若细胞团块未充分解离，转染效率将显著下降。
8. 将iPSCs收集至15 ml锥形管中，以100 ×g离心3分钟。
9. 吸除上清液，用少量E8培养基重悬细胞沉淀。
10. 加入如0.4%台盼蓝等活体染料后，使用血细胞计数板对细胞进行计数。计数时确保细胞已充分解离（每“团”1–3个细胞）。
11. 将3 × 10⁶个细胞分装至两个15 ml锥形管中，再次以100 × g离心3分钟。
    注意：低速离心可减少细胞应激，并有利于电穿孔前iPSCs的重悬。
12. 将电穿孔系统设置为适用于人胚胎干细胞系H9的细胞类型特异性程序（程序CB-150）。
13. 离心后，吸除细胞沉淀中的上清液。向其中一个沉淀中加入10 μg HR供体质粒作为对照样本；向另一沉淀中加入10 μg HR供体质粒以及每种TALEN各5 μg（pZT-AAVS1-L1和pZT-AAVS1-R1）作为实验样本。
14. 将每个细胞沉淀用100 μl P3原代细胞转染液重悬，并转移至电穿孔杯中。
15. 进行电穿孔后，立即向每个电穿孔杯中加入500 μl室温E8培养基。
16. 将转染后的iPSCs逐滴转移至一个预先在步骤5.4中准备好的含DR4 MEFs的10 cm培养皿中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质，*无LDEV，10 ml	Corning	354230	在 -20 °C 下保存。
DMEM/F-12	Life Technologies	11320-033	在 4 °C 下保存。
Costar 6 孔透明 TC 处理多孔板	Corning	3506
Essential 8 培养基	Life Technologies	A1517001	基础培养基在 4 °C 下保存，补充剂在 -20 °C 下保存。
Y-27632 二盐酸盐	Tocris	1254	室温保存。溶解于 H2O 后，于 -20 °C 保存。
氯化钠	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0	Life Technologies	15575-020
不含钙、镁的 DPBS	Life Technologies	14190-250
100 mm TC 处理培养皿	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - 学术用途	GlobalStem	GSC-6204G	在液氮中保存。
DMEM，高糖，含丙酮酸	Life Technologies	11995-040	在 4 °C 下保存。
限定型胎牛血清，美国来源	HyClone	SH30070.03	在 -20 °C 下保存。在 4 °C 过夜解冻并分装。分装后于 -20 °C 保存，直至使用。
MEM 非必需氨基酸溶液（100X）	Life Technologies	11140-050	在 4 °C 下保存。
4D-Nucleofector 核心单元	Lonza	AAF-1001B	电穿孔系统的一部分。
4D-Nucleofector X 单元	Lonza	AAF-1001X	电穿孔系统的一部分。
P3 原代细胞 4D-Nucleofector X 试剂盒 L（24 次反应）	Lonza	V4XP-3024	收到后，取出原代细胞溶液和补充剂，并在 4 °C 下保存。
StemPro Accutase 细胞解离试剂	Life Technologies	A1110501	在 -20 °C 下保存。在 4 °C 过夜解冻，并在使用前将分装样品在 37 °C 水浴中预热。
NutriStem XF/FF 培养基	Stemgent	01-2005	在 -20 °C 下保存。在 4 °C 过夜解冻
AAVS1 TALENs（pZT-AAVS1-L1 和 pZT-AAVS1-R1）	Addgene	52637 和 52638
AAVS1-CAG-EGFP 同源重组供体质粒	Addgene	22212
嘌呤霉素二盐酸盐	Life Technologies	A11138-03	在 -20 °C 下保存。用 ddH2O 配制 1 mg/ml 的工作液分装保存。
一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR（带制冷），120 V 60 Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 × 750 ml 摆动桶转子	Thermo Scientific	75003607
台盼蓝溶液，0.4%	Life Technologies	15250-061