phiC31 整合酶介导的定点转基因整合:一种用于位点特异性转基因整合到按蚊载体中的显微注射技术

1. 用于显微注射混合物的质粒的制备

注意:此处所示的方案涉及使用两种质粒:携带目标转基因的 attB（来源于宿主细菌的附着位点）标记的供体质粒，以及在果蝇 Hsp70 启动子的调节下表达 φC31 整合酶的辅助质粒。

1. 使用无内毒素质粒纯化试剂盒纯化供体和辅助质粒。
   注意:对用于注射的最终质粒制备物进行测序，以验证所有组分的完整性。
2. 将适量的两种质粒混合，在重悬于注射缓冲液中时，得到终浓度为 350 ng/μL 供体质粒和 150 ng/μL 辅助质粒的混合物。
   注意:在计算所需的混合物体积时，考虑到 10-15 μL 足以满足计划注射的每一天，并且可以提前制备 DNA 并储存在 -20 °C。还报道了整合酶辅助质粒浓度为 60-500 ng/μL 和供体质粒浓度为 85-200 ng/μL。
3. 通过加入 0.1 体积的 3 M 乙酸钠 （pH 5.2） 和 2.5 体积的冰冷的 100% 乙醇来沉淀 DNA 并涡旋。白色沉淀物应立即可见。使用高浓度的初始质粒制备物（即 ~1 μg/μL）可提高沉淀效率。
   注意:终止点 - 沉淀物可在 -20 °C 下储存过夜。
4. 在 4 °C 下以 15,000 x g 离心 20 分钟，弃去上清液，并用 1 mL 冰冷的 70% 乙醇洗涤沉淀。
5. 用 1 mL 冰冷的 70% 乙醇洗涤沉淀，并在室温下以 15,000 x g 离心 5 分钟。
6. 弃去上清液，不要干扰沉淀并风干。
7. 将沉淀重悬于 1x 注射缓冲液（0.1 mM Na₃PO₄、5 mM KCl、pH 7.2、0.22 μm 过滤器灭菌）中，以达到 500 ng/μL.
   的总终浓度 注意:假设在沉淀过程中会丢失一些 DNA;因此，首先加入较小体积的进样缓冲液，在分光光度计（例如 Nanodrop）上检查浓度，然后加入适当的剩余体积以达到 500 ng/μL。
8. 确保 DNA 完全重悬，制备 10-15 μL 的等分试样，并将其储存在 -20 °C 下。
9. 在注射当天，解冻一份等分试样并以 15,000 x g 离心 5 分钟以去除任何颗粒残留物。
   注:去除颗粒的另一种方法是通过 0.22 μm 过滤器过滤溶液。避免注射混合物中存在颗粒残留物，因为它们会导致胚胎显微注射过程中针头堵塞。

2. 从 Anopheles 对接线显微注射胚胎

在
1. 显微注射前 72 小时从所需的对接线给 4-7 日龄的蚊子喂血（即，周一和周二注射，前周五喂养雌性;周四和周五注射，在同一周的周一喂养雌性）。
2. 在同一天对野生型 （WT） 蚊子（即，与对接线具有相同基因组背景的蚊子）进行血液喂养;这些将是异交所必需的。
   注意:血粉的大小和质量会影响卵子质量，因此建议始终使用新鲜血液（即在过去 7 天内抽取的血液）。手臂喂养或喂养小鼠可能会增加鸡蛋的质量和数量，但不鼓励这些方法。人类和动物使用需要特定的批准方案。
3. 进行胚胎显微注射
   1. 通过在 25 mM NaCl 中以 45 度角瞄准胚胎的后极，进行冈比亚人胚胎显微注射。有关胚胎收集、对齐和显微注射的详细方案，请参阅 Pondeville 等人。和 Lobo 等人。
   2. 在卤烃油 700:27 （2:1） 中以 30 度角瞄准胚胎的后极，进行 An. stephensi 胚胎显微注射。胚胎收集、对齐和显微注射的详细方案可以在 Terenius 等人中找到。和 Lobo 等人。
   3. 注射后立即将卵转移到装有无菌蒸馏水 （pH 7.2） 的培养皿中，并将它们放回昆虫条件。
4. 孵化后，每天将 G₀ 幼虫转移到装有盐蒸馏水（0.1% 滋补盐）的托盘中，然后转移到蛹后面。
5. 创纪录的孵化率（即孵化的幼虫数量/注射的胚胎数量）
   注意:胚胎运动有助于孵化，因此需要轻柔的旋转。孵化应在注射后 ~48 小时开始。由于注射可能会导致轻微的发育延迟，因此建议监测晚孵化的幼虫 3-4 天。