phiC31整合酶介导的定点转基因整合：一种用于将转基因特异性整合至基因组位点的显微注射技术 按蚊属 载体

摘要

来源：Adolfi, A., Lynd, A., Lycett, G. J., James, A. A. 定点突变 φC31介导的整合与盒式交换 按蚊属 疟疾的传播媒介 视频实验杂志 (2021).

在本视频中，我们通过显微注射展示了在Anopheles胚胎中利用phiC31介导的位点特异性外源基因整合技术。该方法有助于将目的基因导入宿主系统，用于科研与工业应用。

方案

1. 显微注射混合物质粒的制备

注意：本实验方案涉及使用两种质粒：一种是携带目的转基因且带有 attB（源自宿主细菌的附着位点）标签的供体质粒，另一种是辅助质粒，该质粒在 Drosophila Hsp70 启动子调控下表达 φC31 整合酶。

1. 使用无内毒素质粒纯化试剂盒纯化供体质粒和辅助质粒。
   注意：对用于注射的最终质粒制备物进行测序，以验证所有组分的完整性。
2. 将两种质粒按适当比例混合，使其在注射缓冲液中重悬后的终浓度为供体质粒 350 ng/µL，辅助质粒 150 ng/µL。
   注意：计算所需混合液体积时，应考虑到每天计划注射量约为 10–15 µL；DNA 可预先配制并储存于 -20 °C。已有文献报道整合酶辅助质粒浓度范围为 60–500 ng/µL，供体质粒浓度范围为 85–200 ng/µL。
3. 加入 0.1 体积的 3 M 醋酸钠（pH 5.2）和 2.5 体积的预冷无水乙醇（100% EtOH），涡旋混匀以沉淀 DNA。应立即可见白色沉淀物。初始质粒浓度较高（即，约 1 µg/µL）有助于提高沉淀效率。
   注意：可在此处暂停——沉淀物可在 -20 °C 保存过夜。
4. 在 4 °C 下以 15,000 x g 离心 20 分钟，弃上清，并用 1 mL 预冷的 70% EtOH 洗涤沉淀。
5. 用 1 mL 预冷的 70% EtOH 洗涤沉淀，并在室温下以 15,000 x g 离心 5 分钟。
6. 弃上清时避免扰动沉淀，然后空气干燥。
7. 将沉淀重悬于 1× 注射缓冲液（0.1 mM Na₃PO₄，5 mM KCl，pH 7.2，经 0.22 µm 滤膜除菌）中，使总终浓度达到 500 ng/µL。
   注意：假设在沉淀过程中会损失部分 DNA；因此，应先加入较少体积的注射缓冲液，用分光光度计（如 Nanodrop）检测浓度，再加入适量缓冲液调整至 500 ng/µL。
8. 确保 DNA 完全重悬，分装为每份 10–15 µL，储存于 -20 °C。
9. 注射当天，取出一份解冻，并在 15,000 x g 下离心 5 分钟，以去除任何颗粒残留物。
   ​注意：去除颗粒的另一种方法是将溶液通过 0.22 µm 滤膜过滤。应避免注射混合液中存在颗粒残留，因其会导致胚胎显微注射过程中针头堵塞。

2. 来自一个品系的胚胎显微注射 按蚊属 系泊缆绳

1. 从目标品系中选取4至7日龄的蚊子，在显微注射前72小时进行血液饲喂（即注射时间为周一和周二时，需在前一个周五对雌性果蝇进行喂食；注射时间为周四和周五时，需在当周周一对其进行喂食。
2. 对野生型（WT）蚊子进行血液饲喂（即同一天准备具有相同插入品系基因组背景的蚊子，这些蚊子将用于杂交。
   注意： 血液餐的体积和质量会影响卵的质量，因此建议始终使用新鲜血液（即， 7天内采集的血液）。使用人臂饲喂或小鼠饲喂可能提高卵子的质量和数量，但不推荐采用这些方法。如需使用人类或动物宿主，必须遵循特定的批准方案。
3. 进行胚胎显微注射
   1. 执行 An. gambiae 在 25 mM NaCl 中进行胚胎显微注射 以45度角瞄准胚胎的后极。有关胚胎收集、排列和显微注射的详细方案，请参见Pondeville 等 和 Lobo 等
   2. 执行 An. stephensi 在卤代烃油700:27（2:1）中进行胚胎显微注射，针头以30度角对准胚胎后极。有关胚胎收集、排列和显微注射的详细方案可参见Terenius 等 和 Lobo 等
   3. 注射后立即将卵转移至含有无菌蒸馏水（pH 7.2）的培养皿中，并放回昆虫饲养环境。
4. 孵化后，转移 G₀ 每天将幼虫转移至含有盐蒸馏水（0.1% 张力盐）的培养皿中，饲养至化蛹。
5. 记录孵化率（即， 孵化幼虫数/注射胚胎数
   注意： 胚胎运动有助于孵化，因此轻柔地晃动是可取的。孵化通常应在注射后约48小时开始。由于注射可能导致轻微的发育延迟，建议持续监测晚孵化的幼虫3至4天。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 离心管
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)	Qiagen	12362
乙醇，分子生物学级，纯度100%
卤代烃油 27	Sigma	H8773
卤代烃油 700	Sigma	H8898
培养皿
Potassium chloride
氯化钠
磷酸氢二钠
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2	Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)	R1181
稳定型细刷，0号尺寸