基于 CRISPR 干扰的基因沉默:一种靶向抑制致病性钩端螺旋体基因功能的技术

摘要

来源:Fernandes， L. G. V. et al.CRISPR 干扰 （CRISPRi） 在钩端螺旋体病原菌种属基因沉默中的应用。J. Vis. Exp.（2021 年）。

该视频演示了致病性钩端螺旋体中基于 CRISPR 干扰的基因沉默。使用阻断 mRNA 形成的 CRISPR/Cas 系统靶向抑制基因表达有助于识别用于病理学和药理学研究的候选基因。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 原间隔区定义和质粒构建

>注意:在本节中，描述了选择合适的前间隔区来构建 sgRNA 并进一步连接到 pMaOri.dCas9 的第一步（图 1）。该前间隔序列由针对所需靶标的 20 个核苷酸序列组成。

1. 获取目标基因的核苷酸序列，以便在 GenBank （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank） 进行沉默。将其提交给 CHOPCHOP 网络服务器 （http://chopchop.cbu.uib.no/），在选择"Fasta Target"后，为化脓性链球菌 Cas9 和原间隔区相邻基序 NGG 定义参数。定义 "CRISPR/Cas9" 和 PAM （protospacer adjacent motif） NGG 的参数。
2. 根据获得的结果，选择具有最佳分数（绿色箭头）的原始间隔区，这些原间隔区尽可能靠近编码区的 5' 端，最重要的是，包含在模板（减）链中，因为 sgRNA 必须与基因的编码链配对才能完全沉默基因。
   注意:NGG 基序不包含在最终的 sgRNA 序列中。
3. 使用 lipL32 启动子表达单向导 RNA，该 RNA 在 5' 末端包含一个可变的 20 个核苷酸序列和一个保守的 dCas9 支架序列。将称为前间隔区的 20-nt 序列合并到 lipL32 启动子（在其 5' 端）和 sgRNA 支架（3' 端）（图 1B）
   注意:对于定义明确的 lipL32 启动子，利用包含 -334 到 TSS（转录起始位点，基于 Zhukova 等人）的启动子区域。检查表 1 中的最终 sgRNA 盒。
4. 通过顺序 PCR 生成 sgRNA 盒，或由商业提供商合成。
5. 获得盒后，将其连接到两端 XmaI 限制性位点 （cccggg） 的 pMaOri.dCas9 质粒中。
   1. 用 XmaI 限制性内切酶消化 sgRNA 盒和 pMaOri.dCas9 质粒，然后进行连接（图 1B）。
   2. 由于 pMaOri（以及扩展的 pMaOri.dCas9）复制起点 R6K-gamma.
      ，在 dT 营养缺陷型大肠杆菌菌株 π1 中执行克隆步骤 注:有关连接和克隆选择的详细方案，请参阅 Fernandes 和 Nascimento 以前的出版物。sgRNA 引导的 dCas9 将与所选目标基因的编码链结合，因此会阻碍 RNA 聚合酶的延伸（图 1C），导致基因沉默。

2. 通过共轭转化钩端螺旋体

注意:图 2 显示了此步骤的图形方案。要制作 HAN 培养基和 HAN 印版，请参考 Hornsby 等人和 Fernandes 等人。

1. 通过在新鲜HAN中以1:100稀释饱和培养物，在29或37°C的HAN培养基中搅拌培养致病性钩端螺旋体细胞;通常，询问乳杆菌血清型哥本哈根尼菌株Fiocruz L1-130需要4-6天才能达到适当的细胞密度。
   1. 在用于偶联之前，确保培养物在 420 nm 处达到 0.2-0.4 的外径（2 至 5 x 10⁸ 个细胞/mL><）。 注意:由于 HAN 培养基随着细胞密度的增加而变色（由于 DMEM 培养基中含有酚红），因此离心（4,000 x g，15 分钟，室温）1 mL 培养基以去除钩端螺旋体，并应用上清液作为空白测量 OD。
2. 用含有 sgRNA 盒的质粒 pMaOri.dCas9 转化共轭大肠杆菌菌株 β2163，该菌株对二氨基庚酸 （DAP） 具有营养缺陷型。对于大肠杆菌转化，使用热休克方案或电穿孔。包括用质粒 pMaOri.dCas9 进行转化，没有 sgRNA 盒作为对照。
   1. 对于热休克转化，将质粒 DNA （100 ng） 与化学感受态大肠杆菌细胞混合，并在冰上孵育 30 分钟。在 42 °C 下进行热休克 90 秒，然后再次置于冰上 5 分钟。通过添加 1 mL LB 培养基回收细胞，在 37 °C 下孵育 1 小时，然后进行电镀。
   2. 对于电穿孔，使用与 100 ng 质粒 DNA 混合的电感受态细胞。对脉冲使用以下参数:1.8 kV、100 Ω 和 25 μF。如上所述恢复电池。
   3. 将转化的供体大肠杆菌细胞接种在补充有二氨基庚二酸 （DAP） （0.3 mM） 和壮观霉素 （40 μg/mL） 的 LB 琼脂培养基中，以筛选质粒。
3. 对于缀合，在缀合前一天从每个平板中选择一个菌落（通过监测钩端螺旋体培养物的外径来确定）。
   1. 从空的 pMaOri.dCas9 中选择一个大肠杆菌 β2163 菌落，从 pMaOri.dCas9sgRNA 板中选择一个菌落。让它们在 37 °C 下在 10 mL LB 加 DAP 和壮观霉素中生长过夜。
   2. 第二天，在 10 mL 新鲜 LB 加 DAP（此处不包括抗生素）中以 1:100 的比例稀释饱和培养物，直到 OD_420nm 为 0.2-0.4。通常，大肠杆菌需要 2-3 小时才能达到这些密度。
4. 在 BSL2 生物安全罩内，通过在玻璃底座顶部放置直径为 25 mm、孔径为 0.1 μm 的混合纤维素酯膜过滤器来组装过滤装置。在顶部放置一个 15 mL 玻璃漏斗，并用弹簧夹固定两块。将玻璃杯连接到真空泵，并将培养物添加到漏斗中进行过滤。
5. 向漏斗中加入 5 mL 钩端螺旋体培养物。添加一定体积的大肠杆菌，以根据两种培养物的 OD_{420 nm} 值构成 1:1 的比例。打开真空泵并通过过滤浓缩细胞。细胞在膜过滤器中浓缩后，小心地取回它。确保培养基通过膜过滤。
   注意:过滤需要 5 到 10 分钟。
6. 将过滤器放在市售的 EMJH 板上（参见材料表），补充有 DAP （0.3 mM）。确保细菌侧朝上。将板在29°C孵育24小时
   注意:如果使用 HAN 或补充的内部 EMJH 板，大肠杆菌可以增殖并克服预期的 1:1 比例，这反过来会降低偶联效率。
7. 24 小时后，从板中回收过滤器，并将每个单独的过滤器放入 50 mL 锥形管中。
8. 使用 1 mL 液体 HAN 培养基通过大量移液和涡旋将细胞从过滤器表面释放出来。
9. 通过暗场显微镜观察回收的混合细菌溶液，以检查细胞活力和运动性，以及钩端螺旋体:大肠杆菌比例。
   注意:在这个阶段，可以看到同等数量的大肠杆菌和钩端螺旋体。
10. 将 100-200 μL 这种培养物涂布到含有 0.4% 灭活兔血清和 40 μg/mL 壮观霉素的 HAN 平板上。在 37 °C 和 3% CO₂ 气氛中孵育板><。 强>注意:正常情况下，询问乳杆菌血清型哥本哈根尼菌株 Fiocruz L1-130 细胞在对照板上 5-7 天形成菌落，在大观霉素平板上 8-10 天形成菌落。在这个阶段，大肠杆菌不会生长，因为它们对 DAP 具有营养缺陷型。
11. 作为对照，以 10⁴ 钩端螺旋体/mL 的浓度稀释培养物，并在不含抗生素的平板上添加 100 μL，以监测钩端螺旋体的生长。

结果

表格 border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" width="623">

sgRNA 盒应为:
cccgggGAACAAGAAAGAAGGTCAGAGAATTATTGAAGAGATACTCTTATACTACCGTCTTTGGAAGAATTTTCGCATGGATTTTAGATTTGCTGGACTGGTTGAAGCGATTTTTCAAAAAATAATCAATTTGTGTGTGTGTTTGAGATTTGAAAACGCTTTTTAAGAATCTGATGTTTCAATCGTATAGAAATCTCTTAAGACTTATATAACAATCGCTTTAAACTCAAATTATAATCTCAGATAAAAAATTATTCAATATTCAATATTCATAAAAATTCCTAAGTTCATACCGTGATTTTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTcccgg...

材料