基于 CRISPR 干扰的基因沉默:一种靶向抑制致病性钩端螺旋体基因功能的技术

摘要

来源:Fernandes， L. G. V. et al.CRISPR 干扰 （CRISPRi） 在钩端螺旋体病原菌种属基因沉默中的应用。J. Vis. Exp.（2021 年）。

该视频演示了致病性钩端螺旋体中基于 CRISPR 干扰的基因沉默。使用阻断 mRNA 形成的 CRISPR/Cas 系统靶向抑制基因表达有助于识别用于病理学和药理学研究的候选基因。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 原间隔区定义和质粒构建

>注意:在本节中，描述了选择合适的前间隔区来构建 sgRNA 并进一步连接到 pMaOri.dCas9 的第一步（图 1）。该前间隔序列由针对所需靶标的 20 个核苷酸序列组成。

1. 获取目标基因的核苷酸序列，以便在 GenBank （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank） 进行沉默。将其提交给 CHOPCHOP 网络服务器 （http://chopchop.cbu.uib.no/），在选择"Fasta Target"后，为化脓性链球菌 Cas9 和原间隔区相邻基序 NGG 定义参数。定义 "CRISPR/Cas9" 和 PAM （protospacer adjacent motif） NGG 的参数。
2. 根据获得的结果，选择具有最佳分数（绿色箭头）的原始间隔区，这些原间隔区尽可能靠近编码区的 5' 端，最重要的是，包含在模板（减）链中，因为 sgRNA 必须与基因的编码链配对才能完全沉默基因。
   注意:NGG 基序不包含在....

结果

表格 border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" width="623">

sgRNA 盒应为:
cccgggGAACAAGAAAGAAGGTCAGAGAATTATTGAAGAGATACTCTTATACTACCGTCTTTGGAAGAATTTTCGCATGGATTTTAGATTTGCTGGACTGGTTGAAGCGATTTTTCAAAAAATAATCAATTTGTGTGTGTGTTTGAGATTTGAAAACGCTTTTTAAGAATCTGATGTTTCAATCGTATAGAAATCTCTTAAGACTTATATAACAATCGCTTTAAACTCAAATTATAATCTCAGATAAAAAATTATTCAATATTCAATATTCATAAAAATTCCTAAGTTCATACCGTGATTTTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTcccgg.......

材料