基于CRISPR干扰的基因沉默：一种在致病性Leptospira中靶向抑制基因功能的技术

摘要

来源：Fernandes, L. G. V., 等. CRISPR干扰（CRISPRi）在致病性物种中用于基因沉默的应用 钩端螺旋体. 视频实验杂志 (2021).

本视频演示了在致病性Leptospira中基于CRISPR干扰的基因沉默技术。利用CRISPR/Cas系统靶向抑制基因表达，阻断mRNA的形成，有助于识别用于病理学和药理学研究的候选基因。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 原间隔序列的确定与质粒构建

注意：本节介绍了构建sgRNA并进一步连接至pMaOri.dCas9过程中的第一步，即选择合适的原间隔序列（图1）。该原间隔序列包含一段针对目标序列的20个核苷酸的序列。

1. 在 GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）获取目标沉默基因的核苷酸序列。将其提交至 CHOPCHOP 网络服务器（http://chopchop.cbu.uib.no/），在选择“Fasta Target”后，设置参数为 Streptococcus pyogenes Cas9，并选择位于其后的原间隔序列邻近基序（PAM）为 NGG。将参数定义为“CRISPR/Cas9”和 PAM（原间隔序列邻近基序）NGG。
2. 根据所得结果，选择评分最高（绿色箭头所示）的原间隔序列，其位置应尽可能靠近编码区的 5´端；最重要的是，该序列必须位于模板链（负链）上，因为 sgRNA 必须与基因的编码链配对，才能实现完全的基因沉默。
   注意： NGG 基序不包含在最终的 sgRNA 序列中。
3. 使用 lipL32 启动子表达单链向导 RNA（sgRNA），该 sgRNA 在 5' 端包含一段可变的 20 个核苷酸序列，在 3' 端包含一段保守的 dCas9 支架序列。将称为原间隔序列的 20-nt 序列连接至 lipL32 启动子（在其 5´端）和 sgRNA 支架序列（3'端）（图 1B）。
   注意： 对于明确界定的 lipL32 启动子，可采用包含从 -334 至转录起始位点（TSS，基于 Zhukova 等人的研究）的启动子区域。最终的 sgRNA 表达盒请参见 表 1。
4. 通过连续 PCR 扩增生成 sgRNA 表达盒，或由商业公司合成该片段。
5. 获得表达盒后，将其在两端通过 XmaI 限制性酶切位点（cccggg）连接至 pMaOri.dCas9 质粒。
   1. 使用 XmaI 限制性内切酶对 sgRNA 表达盒和 pMaOri.dCas9 质粒进行双酶切，随后进行连接反应（图 1B）。
   2. 由于 pMaOri（以及由此衍生的 pMaOri.dCas9）复制起点为 R6K-gamma，克隆步骤需在 dT 营养缺陷型的 E. coli 菌株 π1 中进行。
      ​注意：有关连接反应和克隆筛选的详细实验方案，请参考 Fernandes 和 Nascimento 之前的出版物。由 sgRNA 引导的 dCas9 将结合至目标基因的编码链，从而阻碍 RNA 聚合酶的延伸（图 1C），最终导致基因沉默。

2. 通过接合转化 Leptospira

注意： 本步骤的示意图见图2。配制HAN培养基和HAN平板，请参考Hornsby等和Fernandes等的研究。

1. 培养致病菌 钩端螺旋体 在29或37 °C下，将饱和培养物以1:100比例接种于新鲜HAN培养基中，在振荡条件下培养细胞；通常， L. interrogans 血清型Copenhageni菌株Fiocruz L1-130需要4至6天才能达到适当的细胞密度。
   1. 确保培养物在420 nm处的光密度（O.D.）达到0.2–0.4（相当于2至5 × 10⁸ CFU/mL）⁸ 细胞/mL）后用于偶联。
      注意： 由于HAN培养基会随着细胞密度的增加而改变颜色（源于DMEM培养基中含有的酚红），需离心（4,000 x g，15 分钟，室温）加入 1 mL 培养基以去除钩端螺旋体，将上清液作为空白对照用于测定 O.D.
2. 转化接合的 E. coli 菌株β2163，为二氨基庚二酸（DAP）营养缺陷型，携带含有sgRNA表达盒的质粒pMaOri.dCas9。对于 E. coli 转化，采用热激法或电穿孔法。以不含sgRNA表达盒的质粒pMaOri.dCas9进行转化作为对照。
   1. 热激转化时，将质粒DNA（100 ng）与化学感受态细胞混合 E. coli 细胞在冰上孵育30分钟。42 °C热激90秒后，再次置于冰上5分钟。加入1 mL LB培养基复苏细胞，37 °C孵育1小时，然后进行涂板。
   2. 电穿孔时，使用电转感受态细胞与100 ng质粒DNA混合。电击参数设置为：1.8 kV、100 Ω和25 µF。按上述方法进行细胞复苏。
   3. 接种转化后的供体 E. coli 在添加二氨基庚二酸（DAP）（0.3 mM）和壮观霉素（40 μg/mL）的LB琼脂培养基中培养细胞，以筛选质粒。
3. 接合前一日，根据钩端螺旋体培养物的光密度（O.D.）监测结果确定接合时间，并从每块平板上各挑选一个单菌落。
   1. 选择一个菌落 E. coli β2163 菌株分别接种于空质粒 pMaOri.dCas9 和含 pMaOri.dCas9sgRNA 的平板，加入 10 mL LB 培养基（含 DAP 和壮观霉素），37 °C 过夜培养。
   2. 第二天，将饱和培养物按1:100稀释至10 mL新鲜LB培养基中（含DAP，此处不加抗生素），直至OD_{420 nm} 0.2–0.4。通常需要 2–3 小时 E. coli 以达到这些密度。
4. 在生物安全二级（BSL2）生物安全柜内，将一个直径25 mm、孔径0.1 µm的混合纤维素酯膜过滤器置于玻璃底座上方，组装过滤装置。将一个15 mL玻璃漏斗置于其上，并用弹簧夹固定两部分。将玻璃装置连接至真空泵，然后将培养物加入漏斗中进行过滤。
5. 加入5 mL的 钩端螺旋体 将培养物加入漏斗中。加入一定体积的 E. coli 根据OD值确定1:1的比例_{420 nm} 两种培养物的数值。打开真空泵，通过过滤浓缩细胞。细胞在膜过滤器中浓缩后，小心取出膜过滤器。确保培养基已完全通过膜过滤。
   注意： 过滤需要5到10分钟。
6. 将滤膜置于市售的 EMJH 平板上（参见 材料表加入DAP（0.3 mM）的培养基中。确保细菌面朝上。将平板在29 °C下培养24 h。
   注意： 如果使用 HAN 或补充了自制 EMJH 培养基的平板， E. coli 可能会增殖并打破预期的1:1比例，从而降低接合效率。
7. 24小时后，从培养板中取出滤膜，将每张滤膜分别放入50 mL锥形管中。
8. 使用1 mL液体HAN培养基，通过反复吹打和涡旋振荡从滤膜表面释放细胞。
9. 通过暗视野显微镜观察复苏后的混合细菌溶液，以检测细胞活力和运动性，并 钩端螺旋体：大肠杆菌 比例。
   注意： 在此阶段，数量相等的 E. coli 和 钩端螺旋体 可以观察到。
10. 将100–200 μL该培养物涂布于含有0.4%灭活兔血清和40 μg/mL链霉素的HAN平板上。将平板置于37 °C、5% CO₂条件下培养。₂ 大气
    强>注意：通常情况下， L. interrogans 血清型Copenhageni菌株Fiocruz L1-130在对照平板上5-7天形成菌落，在链霉素平板上8-10天形成菌落。此时， E. coli 由于对二氨基庚二酸（DAP）营养缺陷，将无法生长。
11. 作为对照，将培养物按10倍稀释⁴ 每毫升钩端螺旋体，并取100 μL接种于无抗生素的平板上，以监测钩端螺旋体生长。

结果

sgRNA 表达盒的序列应为： cccgggGAACAAGAAAGAGTCAGAGAATTATTGAAGAGATACTCTTATACTACCGTCTTTGGAAGAATTTTCGCATGGATTTTAGATTTGCTGGACTGGTTGAAGCGATTTTTTCAAAAAAAATAATCAATTTGTGTCTGAGATTTGAAAACGCTTGTTTGATAGTTTTTTAAGAATTTCTGATGTTTCAATCGTATAGAAATTCTAAATTTAGAAATCATCCTTTACTTTTCTCTAAGACTTATATAACAATCGCTTTAAACTCAAATTATAATCTTTCAGATAAAAAATTATTCAATATTGATTTACAAAAAATTCCTAAGTTCATACCGTGATTTTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAG...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 µ混合纤维素酯膜，孔径为 m	默克密理博	VCWP02500	细菌接合过滤法
2,6-二氨基庚二酸（DAP）	Sigma	D1377	营养缺陷型菌株的培养 E. coli β2163
琼脂 Noble	BD & Company	214230	用于制备固体 EMJH 和 HAN 平板
Bacto 琼脂	BD & 公司	214010	用于制备固体LB平板
玻璃微分析滤膜支架	Millipore	XX1012530	细菌接合过滤法
LB肉汤，Miller	BD & 公司	244620	用于溶原性的液体培养基 大肠杆菌 培养
钩端螺旋体 富集 EMJH	BD & Company	279510	EMJH 培养基的补充
钩端螺旋体 EMJH 培养基基础	BD & 公司	279410	钩端螺旋体的 EMJH 培养基
光密度读数仪	Molecular Devices	SpectraMax M2	用于细菌培养物的光密度测定
壮观霉素	Sigma	S0692	pMaOri骨架质粒的筛选
胸腺嘧啶脱氧核苷（dT）	Sigma	T9250	营养缺陷型菌株的培养 E. coli π1
XmaI 限制性内切酶	新英格兰生物实验室	R0180L	质粒和插入片段的消化