基于CRISPR干扰的基因沉默：一种在致病性Leptospira中靶向抑制基因功能的技术

摘要

来源：Fernandes, L. G. V., 等. CRISPR干扰（CRISPRi）在致病性物种中用于基因沉默的应用 钩端螺旋体. 视频实验杂志 (2021).

本视频演示了在致病性Leptospira中基于CRISPR干扰的基因沉默技术。利用CRISPR/Cas系统靶向抑制基因表达，阻断mRNA的形成，有助于识别用于病理学和药理学研究的候选基因。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 原间隔序列的确定与质粒构建

注意：本节介绍了构建sgRNA并进一步连接至pMaOri.dCas9过程中的第一步，即选择合适的原间隔序列（图1）。该原间隔序列包含一段针对目标序列的20个核苷酸的序列。

1. 在 GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）获取目标沉默基因的核苷酸序列。将其提交至 CHOPCHOP 网络服务器（http://chopchop.cbu.uib.no/），在选择“Fasta Target”后，设置参数为 Streptococcus pyogenes Cas9，并选择位于其后的原间隔序列邻近基序（PAM）为 NGG。将参数定义为“CRISPR/Cas9”和 PAM（原间隔序列邻近基序）NGG。
2. 根据所得结果，选择评分最高（绿色箭头所示）的原间隔序列，其位置应尽可能靠近编码区的 5´端；最重要的是，该序列必须位于模板链（负链）上，因为 sgRNA 必须与基因的编码链配对，才能实现完全的基因沉默。
   注意： NGG 基序不....

结果

sgRNA 表达盒的序列应为： cccgggGAACAAGAAAGAGTCAGAGAATTATTGAAGAGATACTCTTATACTACCGTCTTTGGAAGAATTTTCGCATGGATTTTAGATTTGCTGGACTGGTTGAAGCGATTTTTTCAAAAAAAATAATCAATTTGTGTCTGAGATTTGAAAACGCTTGTTTGATAGTTTTTTAAGAATTTCTGATGTTTCAATCGTATAGAAATTCTAAATTTAGAAATCATCCTTTACTTTTCTCTAAGACTTATATAACAATCGCTTTAAACTCAAATTATAATCTTTCAGATAAAAAATTATTCAATATTGATTTACAAAAAATTCCTAAGTTCATACCGTGATTTTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAG.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 µ混合纤维素酯膜，孔径为 m	默克密理博	VCWP02500	细菌接合过滤法
2,6-二氨基庚二酸（DAP）	Sigma	D1377	营养缺陷型菌株的培养 E. coli β2163
琼脂 Noble	BD & Company	214230	用于制备固体 EMJH 和 HAN 平板
Bacto 琼脂	BD & 公司	214010	用于制备固体LB平板
玻璃微分析滤膜支架	Millipore	XX1012530	细菌接合过滤法
LB肉汤，Miller	BD & 公司	244620	用于溶原性的液体培养基 大肠杆菌 培养
钩端螺旋体 富集 EMJH	BD & Company	279510	EMJH 培养基的补充
钩端螺旋体 EMJH 培养基基础	BD & 公司	279410	钩端螺旋体的 EMJH 培养基
光密度读数仪	Molecular Devices	SpectraMax M2	用于细菌培养物的光密度测定
壮观霉素	Sigma	S0692	pMaOri骨架质粒的筛选
胸腺嘧啶脱氧核苷（dT）	Sigma	T9250	营养缺陷型菌株的培养 E. coli π1
XmaI 限制性内切酶	新英格兰生物实验室	R0180L	质粒和插入片段的消化