来源：Jager, J. 等 一种用于研究蛋白质和微小RNA调控对脂肪细胞功能影响的脂肪细胞培养模型. J. Vis. Exp. (2021)。
在本视频中，我们介绍了一种将siRNA反向转染至脂肪细胞以调控目标蛋白表达的实验方法。
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方法文章
基于siRNA逆转录转染的体外基因沉默：一种将小干扰RNA递送至培养细胞以抑制靶基因表达的实验方法
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 预包被板的制备
- 转染前一天或转染前数小时，使用浓度为 1 mg/mL 的胶原蛋白 I 型储备液，以 30% 乙醇配制 100 µg/mL 的胶原蛋白 I 型溶液。每孔 12 孔板加入 250 µL 胶原蛋白溶液，每孔 24 孔板加入 125 µL，并将溶液均匀铺展于孔底表面。
- 将培养板置于超净工作台内，敞盖放置直至胶原溶液完全干燥。用杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）洗涤两次。
注意： 预包被的培养板可直接购买使用。
2. 转染混合物的制备
注意：siRNA 的终浓度范围为 1 至 100 nM（每孔 12 孔板加入 1 至 100 pmol siRNA）。miR 模拟物的终浓度为 10 nM（每孔 10 pmol）。在开始实验前，应预先确定每种 siRNA、miR 模拟物或其他寡核苷酸的最佳浓度，以避免脱靶效应。转染实验应设置三个重复孔，以便对结果进行统计学分析。所有试剂均需过量配制，以补偿移液过程中的正常损耗。
- 用移液器将siRNA（或其他寡核苷酸）与改良的最低必需培养基（表1）混合（体积/体积）。室温孵育5分钟。
- 将转染试剂和改良的最低必需培养基加入siRNA中，用移液器轻轻混匀（表1）。室温孵育20分钟（在此期间，进行第3节操作）。将转染混合物加入胶原包被板的每孔中。
3. 3T3-L1 脂肪细胞的制备
- 用 D-PBS 将 100 mm 培养皿中的细胞洗涤两次。向细胞中加入 5× 胰蛋白酶（每 100 mm 培养皿加 1 mL），确保胰蛋白酶覆盖整个培养皿表面。静置 30 秒后，小心吸除胰蛋白酶。
- 在培养箱中于 37 °C 孵育培养皿 5–10 分钟。轻敲 100 mm 培养皿以使细胞脱落。
- 加入10 ml不含丙酮酸盐、含25 mM葡萄糖、10% FCS和1%青霉素-链霉素的DMEM以中和胰蛋白酶。轻轻吹打培养基，使细胞脱离并混匀细胞悬液。
- 使用血球计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，并将细胞浓度调整至 6.25 × 10⁵ 个/mL5 细胞/mL 培养基。每孔接种 800 µL 细胞悬液至 12 孔板（5 x 10⁵ 细胞/孔）。5 细胞）或每孔400 µl细胞悬液（24孔板，2.5 × 10⁵ 个细胞/孔）5 细胞）加入转染混合物。
注意： 一个100 mm培养皿的脂肪细胞可用于制备一个12孔板或一个24孔板。一个100 mm培养皿通常含有6-7 × 106 脂肪细胞，相当于 5 x 105 每孔脂肪细胞数（12孔板） - 将培养板置于细胞培养箱中（7% CO2，37 °C）孵育，24 h内勿扰动细胞。次日，小心吸去上清液，更换为新鲜的DMEM培养基（不含丙酮酸，含25 mM葡萄糖、10% FCS和1%青霉素-链霉素）。
注意： 也可将细胞接种于胶原蛋白预包被的48孔板和96孔板中，但在更换培养基时需更加小心，以避免脂肪细胞脱落。
| 每孔（12孔板） | 每孔（24孔板） | |
| 寡核苷酸 | 20 µL | 10 µL |
| （si-RNA、miR…） | ||
| 改良最低必需培养基 | 20 µL | 10 µL |
| 转染试剂 | 5.6 µL | 2.8 µL |
| 改良最低必需培养基 | 154.4 µL | 77.2 µL |
| 转染混合物体积总量 | 200 µL | 100 µL |
表1：12孔板和24孔板培养格式所需的转染试剂。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12 孔组织培养板 | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% 胰蛋白酶（10 倍浓度） | Gibco | 15090-046 | 用 D-PBS 稀释至 5 倍浓度 |
| 2-丙醇 | Sigma | I9516 | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A7030 | |
| 小牛皮来源 I 型胶原蛋白 | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco | 41965062 | 含 4.5 g/L D-葡萄糖；L-谷氨酰胺；不含丙酮酸盐 |
| 乙醇 | Sigma | 51976 | |
| miRIDIAN micro-RNA 模拟物 | Horizon Discovery | ||
| FAM 标记的阴性对照 siRNA | Invitrogen | AM4620 | |
| 新生小牛血清 | Gibco | 16010-159 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| 青霉素和链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| FAM 标记的阴性对照 siRNA | Invitrogen | AM4620 | |
| ON-TARGETplus 小鼠 Plin1 siRNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| 游离甘油检测试剂 | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| 培养皿（100 mm × 20 mm） | Dutscher | 353003 | |
| 转染试剂（INTERFERin） | Polyplus | 409-10 | |
| 优化最低必需培养基（Opti-MEM） | Gibco | 31985-047 | |
| 人重组胰岛素 | Gibco | 12585-014 |
