可诱导的 Tet-Off 调控系统：利用四环素-关闭系统在培养细胞中进行基因表达调控的体外方法

摘要

来源：Migneault, F. 等，用于研究原代肺泡上皮细胞中 mRNA 转录本稳定性的高效转录调控质粒表达系统。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频介绍了通过将含有目的基因的质粒和调控质粒共转染培养细胞来调控基因表达的方法。该质粒的表达可由四环素或其合成类似物进行控制，因此该系统是研究可调控基因表达的有用模型。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 将表达目的基因（GOI）的报告质粒转染至原代肺泡上皮细胞

1. 从大鼠肺组织中分离Ⅱ型肺泡上皮细胞。
2. 将细胞以 1 × 10⁶ 个细胞/cm² 的密度接种于含完全最低必需培养基（完全 MEM）的 100 mm 培养皿中。完全 MEM 指在 MEM 基础上添加 10% 胎牛血清（FBS）、0.08 mg/L 妥布霉素、复方新诺明（3 µg/mL 甲氧苄啶和 17 µg/mL 磺胺甲噁唑）、0.2% NaHCO₃、0.01 M HEPES（pH = 7.3）以及 2 mM L-谷氨酰胺。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 的湿润化培养箱中培养 24 小时。
3. 次日，向新的 12 孔板每孔加入 500 µL 不含抗生素的完全 MEM，并在 37 °C 预热 30 分钟。此步骤中，应使用不含四环素污染或四环素含量极低、不足以干扰诱导性的胎牛血清。
4. 在 1.5 mL 离心管中分别加入可诱导的目的基因质粒（GOI 质粒）和调控载体（如 pTet-Off），每孔加入 1 µg GOI 质粒和 1 µg 调控载体，在室温下配制。对于与 RNA 结合蛋白（RBP）共表达的实验，需在 DNA 混合物中额外加入 1 µg 表达目标 RBP 的组成型表达载体（如 pcDNA3）（图 4）。
5. 吸除培养基，并用预热至 37 °C 的磷酸盐缓冲液（PBS，不含钙和镁）轻柔冲洗细胞。
6. 加入 5 mL 预热至 37 °C 的 0.05% 胰蛋白酶，孵育至细胞脱落（2–4 分钟）。加入 10 mL 不含抗生素的完全 MEM 以中和胰蛋白酶活性。
7. 将细胞悬液收集至 50 mL 离心管中，用 4 mL 培养基冲洗培养皿以尽可能回收残留细胞，随后将细胞悬液在 300 × g 条件下离心 5 分钟。
8. 轻柔吸除并弃去上清液，将沉淀用 1 mL PBS 重悬。使用血细胞计数板计数并计算细胞数量。
9. 在 300 × g 条件下离心细胞 5 分钟。轻柔吸除上清液，将沉淀用重悬缓冲液重悬至浓度为 4 × 10⁷ 个细胞/mL。取步骤 2.4 中配制的 1.5 mL 管中的细胞，按每孔 400,000 个细胞的量加入，并通过上下吹打轻柔混匀。
10. 将离心管放入电穿孔装置中，并加入 3.5 mL 电解缓冲液。
11. 将镀金电极头插入移液枪中，完全压下活塞。轻柔混匀 1.5 mL 管中的内容物，并小心用移液枪吸取细胞。注意避免气泡进入枪头，否则在电穿孔过程中会产生电弧，导致转染效率下降。
12. 将移液枪插入电穿孔工作站，直至听到“咔哒”声。
13. 选择适用于肺泡上皮细胞的电穿孔程序，对应脉冲电压为 1,450 V，2 次脉冲，脉宽为 20 ms，然后在触摸屏上按下 开始。
14. 转染后立即取出移液枪，将细胞转移至预先加入已预热至 37 °C 的不含抗生素的完全 MEM 的孔中。
15. 对剩余样品重复步骤 1.11–1.14。
16. 轻柔振荡培养板，使细胞均匀分布于孔底表面。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 的湿润化培养箱中孵育。两天后，更换为含抗生素的完全 MEM。
17. 通过荧光显微镜观察 eGFP 表达或使用表达 eGFP 的对照载体（如 pcDNA3-EGFP）进行流式细胞术分析，以确认转染成功（图 1）。
    注意：此步骤为可选步骤，需额外进行一次使用表达 eGFP 的不同质粒的转染操作。

2. 诱导目的基因的转录抑制

注意：可在诱导多西环素前对细胞进行所需处理，以评估这些处理对 mRNA 稳定性的影响（图 3）。

1. 用去离子水配制浓度为 1 mg/mL 的多西环素储备液。将储备液置于 -20 °C 避光保存。多西环素是一种四环素衍生物，因其半衰期比四环素长（约 2 倍）而被优先选用。此外，完全抑制 tet 操纵子所需的多西环素浓度也更低。
   注意：多西环素可能影响内源性目的基因（GOI）的 mRNA 表达。为验证这一点，应检测多西环素处理 24 小时后对肺泡细胞的影响，以确认目的基因表达未发生改变（图 2）。
2. 转染后 72 小时，用完全 MEM 培养基新鲜配制 1 µg/mL 的多西环素工作液，并将其预热至 37 °C。
3. 每孔加入 1 mL 含 1 µg/mL 多西环素的完全 MEM 培养基，替换原有培养基，以抑制目的基因（GOI）的转录。
4. 将多个孔板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育，分别处理 15 分钟至 6 小时不等，以评估目的基因 mRNA 的半衰期。
5. 处理结束后，用预冷的 PBS 清洗细胞，然后每孔加入 500 µL 裂解缓冲液，使用商品化的苯酚-氯仿 RNA 提取试剂盒裂解细胞，并通过振荡培养板使细胞充分匀浆。
6. 按照试剂盒说明书提取 RNA。通过分光光度法在 230、260 和 280 nm 处测定 RNA 产量和纯度。当 RNA 样品的 260:230 和 260:280 比值分别为 1.8 和 2.0 时，视为纯度合格。
   注意：本实验流程可在此处暂停。

结果

图1：移液管电穿孔法对原代培养肺泡上皮细胞进行转染的效率。 原代肺泡上皮细胞被瞬时转染2 µg pcDNA3质粒（空载体，克隆#1和#2），该质粒表达或不表达GFP蛋白。转染后48小时通过（A）荧光显微镜或（B）流式细胞术评估转染效率。采用单因素方差分析及Bonferroni事后检验；*p < 0.001，与空载体组比较。每种实验条件均使用至少四只不同大鼠的细胞（n ≥ 4）。比例尺 = 200 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
亮线血细胞计数板  	Sigma-Aldrich	Z359629
DM IL LED 倒置显微镜（带相差功能）	 Leica
不含钙和镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（D-PBS）’ 	Wisent Bioproducts	 311-425-CL
盐酸多西环素 	Sigma-Aldrich 	D9891-1G
MEM 粉末	 Gibco 	61100103
MSC-Advantage II 级生物安全柜  	ThermoFisher Scientific	51025413
Neon 转染系统 10 µL 试剂盒  	Invitrogen	MPK1025
Neon 转染系统启动套装  	Invitrogen	MPK5000S
pcDNA3 载体 	ThermoFisher Scientific 	V790-20
pcDNA3-EGFP 质粒	Addgene 	13031
pTet-Off Advanced 载体 	Takara Bio	631070
pTRE-Tight 载体 	Takara Bio	631059
纯化的肺泡上皮细胞 	 n.a.	n.a
QIAEX II 凝胶回收试剂盒  	QIAGEN	20021
QIAGEN 质粒大提试剂盒 	QIAGEN 	12162
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 	QIAGEN	27104
QuantStudio 6 和 7 Flex 实时荧光定量 PCR 系统软件 	Applied Biosystems	 n.a.
Tet 系统认证胎牛血清（FBS） 	Takara Bio	631367