拟南芥植物中基于二元细菌人工染色体载体的基因转化:一种通过单拷贝插入生成转基因植物的技术

1.拟 南 芥转型

1. 准备拟南芥植物进行转化。
   1. 在温室或气候控制的生长室中种植拟南芥植物，直到它们开花（12 个花盆，每个盆 9
   株）。
   2. 夹住第一个螺栓以允许更多次级螺栓出现。植物在剪下后 4-6 天就可以浸泡了，此时植物有许多未成熟的花头，没有很多受精的角果。
2. 花香蘸酱
   1. 在携带用二元细菌人工染色体或 BIBAC 克隆的 T-DNA 的农杆菌悬浮液中浸入花序 5-10 秒。使用温和的搅动。
   2. 用保鲜膜包裹植物的地上部分以保持高湿度，并用盒子盖住花盆，让植物在黑暗中保持。将植物在温室/生长室中孵育 2 天。
   3. 取下盒子和保鲜膜，在温室/生长室中将植物生长至成熟。
      注意:为了提高转化效率，相同的植物可以在第一次浸渍后 7 天重新浸渍。
   4. 收获种子。汇集并分析植物的种子 （T1），用相同的构建体转化，作为一组。
3. 筛选转基因植物。
   1. 为了筛选用 pBIBAC-RFP-GW 衍生物转化的转基因植物，请使用荧光显微镜分析种子。为了检测种皮中的 DsRed 表达，在 560 nm 激发和 600-650 nm 发射下对种子进行成像。使用镊子将荧光种子与非荧光种子分开。
   2. 为了筛选用 pBIBAC-BAR-GW 衍生物转化的转基因植物，将种子播种在装满土壤的托盘中（~2,500 粒种子/0.1 m²）。为确保种子在托盘上均匀分布，将种子悬浮在 0.5x Murashige Skoog 培养基 （MS） 中的 0.1% 琼脂中，并使用 1 mL 移液器铺展种子><。 注意:为了刺激种子以同步方式发芽，请将种子在 4 °C 下孵育至少 2 天。这可以在播种之前或之后完成。
      1. 在托盘中播种后 2 周和 3 周用 0.5% 草铵膦 - 铵溶液喷洒幼苗。每 500 m² 使用 2 mL 草铵膦溶液。
      2. 将幸存的幼苗转移到单独的花盆中。图 1 显示了（第二次）草铵膦处理前后带有幼苗的托盘的典型图像。
      3. 通过 PCR 分析草铵膦抗性植物是否存在感兴趣的构建体。
         1. 分离基因组植物 DNA 用于 PCR。

图 1:草铵膦 - 铵处理前后装满拟南芥幼苗的托盘。不表达存在于 pBIBAC-BAR-GW T-DNA 中的 bar 基因的幼苗在喷洒草铵膦-铵溶液后死亡。照片显示了同一盘幼苗 （A） 喷洒草铵膦前、播种后 14 天和 （B） 喷洒 10 天后，喷洒两次后。