基于双元细菌人工染色体载体的拟南芥基因转化：一种产生单拷贝插入转基因植株的技术

摘要

来源：Tark-Dame, M.，等。利用BIBAC-GW双元载体生成单拷贝插入的转基因植物。J. Vis. Exp. (2018)。

在本视频中，我们演示了转基因的生成 拟南芥 通过稳定转基因表达的植物 农杆菌介导的基于细菌人工染色体的基因转化

方案

1. 拟南芥 转化

1. 制备 拟南芥 用于转化的植物
   1. 培养 拟南芥 在温室或气候可控的生长室中培育植物，直至其开花（每次浸蘸需12个花盆，每盆9株）。
   2. 剪除第一批花序，以促进更多侧生花序的萌发。剪除后4–6天，当植株具有大量未成熟花序且受精角果较少时，即可进行浸蘸处理。
2. 花序浸蘸法
   1. 将花序浸入5–10秒 农杆菌 悬浮液含有克隆在双元细菌人工染色体（BIBAC）中的T-DNA。需轻柔振荡。
   2. 用保鲜膜包裹植物的地上部分以保持高湿度，并用盒子盖住花盆使植物处于黑暗环境中。将植物在温室或生长箱中培养2天。
   3. 移除盒子和保鲜膜，将植物在温室或生长室中培养至成熟。
      注意： 为提高转化效率，可在首次浸染后7天对同一植株再次进行浸染。
   4. 收获种子。将用相同载体转化的植株所产生的种子（T1）汇集后作为一个组合进行分析。
3. 筛选转基因植株。
   1. 使用荧光显微镜分析种子，以筛选含有 pBIBAC-RFP-GW 衍生物的转基因植株。为检测种皮中的 DsRed 表达，采用 560 nm 激发光和 600–650 nm 发射光范围对种子进行成像。使用镊子将发出荧光的种子与无荧光的种子分离。
   2. 为筛选经 pBIBAC-BAR-GW 衍生物转化的转基因植株，将种子播种于装有土壤的育苗盘中（约 2,500 粒种子/0.1 m²）。²）。为确保种子在培养皿中均匀分布，将种子悬浮于0.5×Murashige Skoog培养基（MS）中的0.1%琼脂溶液内，并使用1 mL移液器将种子均匀涂布。
      注意： 为促进种子同步萌发，需将种子在 4 °C 下孵育至少 2 天。此步骤可在播种前或播种后进行。
      1. 播种后2周和3周，用0.5%草铵膦铵溶液对穴盘中的幼苗进行喷雾处理，每1 m²使用500 mL草铵膦铵溶液。².
      2. 将存活的幼苗转移至单独的花盆中。下图显示了在（第二次）草铵膦铵盐处理前后，育苗盘中幼苗的典型图像。 图1.
      3. 通过PCR分析抗草铵膦铵盐的植株中目标表达载体的存在情况。
         1. 提取植物基因组DNA用于PCR。

结果

图1：拟南芥幼苗在施用草铵膦铵盐前后培养皿中的生长情况。Arabidopsis 幼苗若未表达存在于 pBIBAC-BAR-GW T-DNA 中的 bar 基因，则在喷洒草铵膦铵盐溶液后死亡。照片显示同一培养皿中的幼苗（A）在播种后14天、喷洒草铵膦铵盐前的状态，以及（B）喷洒两次后10天的状态。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硫酸卡那霉素一水合物	Duchefa	K0126
Gateway LR Clonase 酶混合液 	Thermo Scientific - Invitrogen	11791-019
MS 培养基（Murashige 和 Skoog 培养基）	Duchefa	M0221
琼脂	BD	214010
草铵膦铵盐（Basta）	Bayer	79391781
磷屏成像仪	GE Healthcare Life Sciences	Typhoon FLA 7000
保鲜膜（Saran wrap）	Omnilabo	1090681
琼脂糖	Thermo Scientific - Invitrogen	16500