吗啉代介导的基因编辑：利用翻译阻断型吗啉代寡核苷酸在单细胞洞穴鱼卵中进行基因敲低的技术 关键词：吗啉代寡核苷酸，基因敲低，翻译阻断，洞穴鱼，单细胞胚胎，基因功能研究，发育生物学

摘要

来源：Stahl, B. A. 等., 墨西哥洞穴鱼基因功能的操作。 J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了一种利用翻译阻断型吗啉环寡核苷酸在洞穴鱼单细胞期进行显微注射以实现基因敲低的技术。吗啉环寡核苷酸是一类可与靶mRNA互补序列结合并阻断其翻译为蛋白质的DNA寡核苷酸。因此，吗啉环寡核苷酸被用作分子工具，以暂时性地抑制或降低基因的表达水平。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 形态寡核苷酸设计

注意：A. mexicanus 的序列可通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）基因数据库（NCBI Gene）和 NCBI 序列读长存档（NCBI SRA，https://www.ncbi.nlm.nih.gov）以及 Ensembl 基因组浏览器（https://www.ensembl.org）获取。在为地表型和洞穴型两种形态设计吗啉寡核苷酸（morpholino）时，关键是在此阶段识别两种形态之间在目标区域的任何遗传变异，以避免将这些存在变异的区域作为吗啉寡核苷酸的靶点。吗啉寡核苷酸靶位点内的任何多态性变异都可能导致结合效率降低或失效。该设计方法与其他鱼类系统（如斑马鱼）类似，且此前已证实可在 A. mexicanus 中有效应用。

1. 翻译阻断型吗啉代寡核苷酸的设计
   注意： 翻译阻断型吗啉代寡核苷酸通过结合内源性起始位点，利用空间位阻阻碍翻译机器与mRNA序列结合，从而阻断翻译过程。
   1. 确定目标基因的编码区，起始位置为ATG起始密码子。
   2. 通过复制粘贴将目标序列的前25个碱基记录到文本编辑器或实验记录本中。
   3. 使用在线软件（例如 http://reverse-complement.com）或手动方式，生成该目标序列的反向互补序列。将所得的反向互补序列保存至文本编辑器或实验记录本中。
   4. 向提供吗啉代寡核苷酸合成服务的公司订购含有该反向互补序列的吗啉代寡核苷酸。参见材料表中的公司列表。

2. 显微注射

1. 注射所需通用工具的准备
   注意： 本节所述步骤在其他地方已有详细描述，此处仅提供概述并附有少量修改。
   1. 将温热的、溶于鱼系统水中的3%琼脂糖倒入100 mL培养皿中制备注射板。将卵注射模具轻轻放入刚倒好的琼脂糖中，以形成用于鱼卵的孔穴。将模具一侧以45°角插入琼脂糖中，然后缓慢将其完全压入；以倾斜角度缓慢压入可避免模具下方困住气泡。待琼脂糖凝固后，轻柔取出模具。注射板可在密封条件下于4 °C保存最多1周。
2. 单细胞期卵的收集
   1. 在预计产卵的夜晚，每隔15–30分钟检查一次鱼缸，并观察缸底是否有卵。卵呈半透明状，直径约为1 mm。
   2. 使用细网孔鱼网收集卵，并将其转移至盛有新鲜鱼系统水的玻璃碗中。在显微镜下检查卵，确认其处于单细胞期。
   3. 使用玻璃移液管将处于单细胞期的卵转移至注射板中。此步骤必须使用玻璃移液管，因为卵会粘附于塑料材质。
   4. 用移液管小心地将卵释放至2.1节所述的预热（室温）琼脂糖注射板的孔穴中。每行尽可能多地放置卵（每行30–40枚，最多可放五行）。排满整行有助于在注射过程中防止卵移动。在进行注射前，保持注射板上的卵湿润，仅需少量鱼系统水即可。
3. 皮升级注射装置设置及通用注射优化指南
   1. 使用可插入毛细管内的凝胶上样移液器吸头或标准微量移液器吸头，向注射针内反向填充，加入2–4 μL的液体。针头充满后，使用镊子剪去注射针过长的部分。
   2. 将注射针安装在显微操作仪上，并连接至皮升级微注射仪进行显微注射。
   3. 设定注射时间为0.03秒，出液压力约为0.0 psi。由于不同针头之间存在微小差异，注射压力需相应调整，以实现约1.0 nL的注射量。
      注意： 注射压力通常在约10–30 psi范围内。
   4. 通过向矿物油中注射并使用载物台测微尺测量液滴大小，标准化注射量，以达到约1–1.5 nL的注射体积。调节注射压力（psi）以增加或减少注射液滴体积。
   5. 用实验室纸巾轻轻吸去卵最表层的水分。
      注意： Astyanax 卵的卵膜比斑马鱼卵稍难穿透。我们发现吸去卵表面水分有助于针头顺利刺入。优化注射板设计可使单个板容纳约200枚卵。
   6. 使用显微操作仪将针头刺入每个卵，并直接注入卵黄中。针头定位至卵黄后，按下注射按钮或脚踏开关进行注射。
      注意： 一整板卵可在约15分钟内完成注射。单细胞期持续时间约为40分钟。
4. 吗啉寡核苷酸（morpholino）注射
   注意： 针对不同基因靶点，需优化吗啉寡核苷酸的使用量，以实现有效敲低且不产生毒性；然而，400 pg可作为起始参考剂量。
   1. 配制吗啉寡核苷酸溶液，使每枚卵注射400 pg。将吗啉寡核苷酸置于冰上解冻。注射液包含所需浓度的吗啉寡核苷酸、无RNase水或Danieau溶液，以及酚红（占终体积的10%）。示例见表1。
   2. 每枚胚胎注射1 nL。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鱼类繁殖 &和卵子供应
细网鱼网	Penn Plax	BN4
鱼缸加热器	Aqueon	100106108
诱卵器	定制	NA	设计并制作塑料格栅，置于水箱底部以保护卵
玻璃移液管	Fisher Scientific	13-678-20C
移液球	Fisher Scientific	03-448-21
琼脂糖	Fisher Scientific	BP160-500
卵壳模具	自适应科学工具	TU-1
Morpholino 试剂供应
对照吗啉代寡核苷酸	Gene Tools, LLC	标准对照油样
定制 Morpholino	Gene Tools, LLC	NA
酚红	Sigma Aldrich	P0290-100ML
显微注射耗材
玻璃毛细管	Sutter Instruments	BF100-58-10
拉管仪	Sutter Instruments	P-97
皮升注射器	Warner Instruments	PLI-100A
显微操作仪	World Precision Instruments	M3301R
显微操作仪	立式世界精密仪器公司	M10
显微操作仪底座	World Precision Instruments	钢制底板，10 磅