吗啉介导的基因编辑:一种在单细胞洞穴鱼卵中使用翻译阻断吗啉寡核苷酸的基因敲低技术

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 吗啉寡核苷酸设计

>注意:墨西哥曲霉的序列可通过国家生物技术信息中心 （NCBI） 基因和 NCBI SRA （https://www.ncbi.nlm.nih.gov） 以及 Ensembl 基因组浏览器 （https://www.ensembl.org） 获得。在设计用于表层和洞穴栖息形式的吗啉时，在此阶段确定形态之间的任何遗传变异至关重要，这样就可以避免这些遗传区域成为吗啉的靶标。吗啉代靶位点内的任何多态性变异都可能导致无效结合。该设计类似于其他鱼类系统，例如斑马鱼，并且之前已被证明在 A. mexicanus 中有效工作。

1. 翻译阻断吗啡的设计
   注意: 翻译阻断吗啉代通过与内源性起始位点结合来阻断翻译，并阻止翻译机制通过空间位阻结合 mRNA 序列><。 1. 确定从 ATG 起始位点开始的靶基因编码区。
   2. 通过在文本编辑器或实验室笔记本中复制和粘贴序列来记录目标序列的前 25 个碱基对><。 3. 使用在线软件（例如 http://reverse-complement.com）或手动翻译，生成目标序列的反向互补。将生成的反向补码保存在文本编辑器或实验室笔记本中。
   4. 从生产吗啉寡核苷酸的公司订购带有反向补体序列的吗啉代。请参阅公司材料表。

2. 显微注射

1. 准备用于注射的通用工具
   注意:本节中的过程已在其他地方详细介绍，此处提供了稍作修改的概述。
   1. 将溶于鱼系统水中的温热 3% 琼脂糖倒入 100 mL 培养皿中，生成进样板。小心地将鸡蛋注射模具放入新鲜倒入的琼脂糖中，为鱼蛋制作孔。将模具的侧面以 45° 角放入琼脂中，然后慢慢将其放入琼脂糖中;以一定角度缓慢降低模具可避免空气滞留在模具下方。琼脂糖凝固后，轻轻去除霉菌。板可以在 4 °C 下储存、密封长达 1 周。
2. 单细胞期种蛋的收集
   1. 预计繁殖的晚上，每 15-30 分钟检查一次水箱，并监测水箱底部的鸡蛋。鸡蛋呈半透明状，直径约为 1 毫米。
   2. 使用细网鱼网收集鸡蛋，并将其转移到装满新鲜鱼系统水的玻璃碗中。在显微镜下检查鸡蛋，以确认鸡蛋处于单细胞阶段。
   3. 使用玻璃移液器，将单细胞鸡蛋转移到注射板中。在这个阶段需要玻璃移液器，因为鸡蛋会粘在塑料上。
   4. 使用移液管，小心地将鸡蛋释放到第 2.1 节中的琼脂糖注射板的孔中。在预热（室温下）注射板的行中填充最大数量的鸡蛋（每行 30-40 个，最多 5 行）。整行有助于防止鸡蛋在注射过程中移动。用少量鱼系统水保持鸡蛋在注射板上的水合，直到注射完成。
3. Pico 注入设置和一般注入优化指南
   1. 使用适合毛细管内的凝胶加载移液器吸头或使用标准微量移液器吸头回填注射针头，并在末端添加 2–4 μL 推注。填充针头后，使用镊子修剪注射针上多余的长度。
   2. 使用安装在显微作器中的针头进行显微注射，该针头连接到皮升显微注射器。
   3. 将注射时间设置为 0.03 秒，压力为 ~0.0 psi。注射压力会因针头之间的细微差异而相应变化，因此请优化以实现 ~1.0 nL 注射推注。
      注意:注射压力通常在 ~10–30 psi 的范围内。
   4. 通过注入矿物油并使用载玻片千分尺测量推注大小来标准化进样推注，以实现 ~1–1.5 nL 进样体积。调整注射压力 （psi） 以增加或减少推注量。
   5. 用实验室纸巾从鸡蛋的最顶部吸出水。
      注意:Astyanax 鸡蛋绒毛膜比斑马鱼蛋更难穿透。我们发现，从鸡蛋顶部吸水有助于促进针头渗透到鸡蛋中。板优化可以允许在单个板上放置 ~200 个鸡蛋。
   6. 使用显微作器用针头穿透每个鸡蛋，然后将其直接注射到蛋黄中。放入蛋黄后，按下注射按钮或注射脚踏板注射鸡蛋><。 注意:可以在 ~15 分钟内注射完整的板。单细胞阶段持续 ~40 分钟。
4. 注射吗啉代 /
   注意:需要优化每个基因靶标在不引起毒性的情况下敲低所需的吗啉代的量;但是，400 pg 的浓度是一个很好的起点。
   1. 准备吗啉，以便每个鸡蛋注射 400 pg 吗啉。在冰上解冻吗啉。注射液由吗啉代（所需浓度）、不含 RNase 的 H 2 O 或 Danieau 溶液和酚红（最终体积的 10%）组成。有关示例，请参阅 表 1。
   2. 每个胚胎注射 1 nL。