Tol2 转座子介导的斑马鱼转基因：通过共注射 Tol2 系统至受精斑马鱼胚胎制备转基因斑马鱼的操作流程

摘要

来源：Silic, M. R., 等. 斑马鱼早期胚胎和肿瘤中细胞电活动的可视化. J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们演示了一种生成稳定表达荧光电压指示蛋白的斑马鱼转基因品系的方法，该方法通过共同注射包含转座酶 mRNA 和编码荧光电压指示蛋白的 Tol2 转座子构建体的 Tol2 转座子系统实现。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 显微注射

1. 在注射前一个下午设置4-6个繁殖缸，每缸至少放入2条雄鱼和2条雌鱼。这些鱼在下午不要喂食。此步骤可减少鱼类排泄物，节省第二天早晨清理时间，同时有助于诱导产卵反应。
2. 次日早晨，从-80 °C冰箱中取出预先配制的注射溶液，包括：(i) 含有斑马鱼泛素启动子和荧光电压指示基因加速动作电位传感器1（ASAP1）的Tol2转座子构建体，以及(ii) Tol2 mRNA，并将其置于冰上。
3. 移除繁殖缸中的隔板，让鱼自由交配。通常情况下，移除隔板后20-30分钟内鱼会产卵。若未产卵，可再等待1-2小时。部分鱼可能完全不产卵，在此情况下需重复实验以收集鱼胚胎。
4. 等待期间，确保已准备好针头，使用镊子以一定角度折断针尖，形成斜面边缘，或在精细擦拭纸上折断。
   1. 使用显微拉针仪从毛细玻璃管拉制针头，参数设置如下：加热温度545；拉力60；速度80；时间250；压力500。在解剖显微镜下（借助目镜标尺估算直径），用镊子以约45°角夹住针头将其折断。所需针头直径可根据显微注射仪设置而变化，但较小直径更佳，有助于降低胚胎死亡率。
5. 鱼产卵后，将卵收集至直径10 cm的培养皿中，并转移至解剖显微镜下。去除所有异常胚胎及鱼排泄物。
6. 用移液器将受精胚胎转移至预先准备的3%琼脂糖注射模具中。去除多余水分，以帮助固定胚胎位置。
7. 当所有行均被有活力的胚胎填满后，调整其方向，使所有单细胞朝向同一方向面对针头，水平方向约呈45°角。这将使后续注射操作更加容易。
8. 戴手套后，使用20 μL上样移液枪头，从冰上的管中吸取5 μL预先配制的构建体溶液。
9. 小心将枪头插入折断的毛细管后端，直至其开始变细处，以使试剂尽可能靠近针尖。若仍有气泡，轻轻摇动针头，注意不要折断针尖。
10. 将针头垂直插入显微注射针头夹持器中，小心拧紧直至针头固定不动。调整角度至约45°。
11. 针头准备并安装完毕后，打开显微镜和气体压力罐。商用CO₂气罐通常适用于此目的。注射体积通过维持压力和喷射压力调节：维持压力约0.5 psi，喷射压力约30 psi。务必检查踩下脚踏开关时是否有溶液排出。
12. 使用带有矿物油液滴的载物台测微尺，调节溶液流出量和流速，使液滴直径约为150 μm（约2 nL）。确保背压能使少量液体从针尖缓慢滴出。若背压不足，毛细作用会导致液体进入针内，破坏mRNA。
13. 针头校准完成后，开始将构建体注射入受精胚胎的单细胞中。
    注意：由于细胞膜较难刺穿，该操作需要大量练习、耐心和技巧。为获得转基因斑马鱼，必须将溶液注入细胞而非卵黄中，这一点与吗啉代寡核苷酸注射不同。只要构建体进入细胞，针头从哪一侧进入细胞并不重要。若将构建体注入卵黄而非细胞，转基因成功率将极低。必须在单细胞阶段进行注射，否则会产生体细胞嵌合体鱼，从而降低外源基因进入生殖细胞的可能性。
14. 利用凝胶凹槽边缘作为支撑，固定胚胎位置，使针头施加压力时胚胎不会移动。当针尖进入单细胞后，踩下脚踏开关释放所需量的溶液。对所有胚胎重复此过程。
15. 注射完成后，用鱼房系统水和一次性3.4 mL移液管冲洗出琼脂糖凹槽中的胚胎，转移至标记好的培养皿中。将胚胎置于28.5 °C培养箱中孵育，使其正常发育。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖 RA	Amresco	N605-500G	用于制备显微注射凝胶
明场解剖显微镜	Nikon	SMZ 745	去卵膜、显微注射、样品固定
一次性移液管 3.4 ml	Thermo Scientific	13-711-9AM	用于鱼胚胎和水的转移
5号镊子	WPI	500342	用于去卵膜和折断针头
上样吸头	Eppendorf	930001007	用于将注射液装入毛细玻璃针
显微注射模具	Adaptive Science Tools	TU-1	用于制备琼脂糖模具托盘，以在注射过程中固定鱼胚胎
显微注射仪	WPI	Pneumatic Picopump PV820	显微注射用注射装置
显微操作器	WPI	Microinjector MM3301R	用于显微注射操作
微量移液管拉制仪	Sutter instrument	P-1000	用于制备毛细玻璃针
矿物油	Amresco	J217-500ml	用于校准注射体积
塑料培养皿	VWR	25384-088	用于成像过程中盛放鱼类或鱼胚胎
台式显微测微尺	Am Scope	MR100	显微注射体积校准
薄壁玻璃毛细管	WPI	TW100F-4	用于制作毛细玻璃针的原始玻璃材料