PiggyBac 转座子介导的人类iPSC基因编辑：利用PiggyBac转座子系统在人类iPSC中整合目的基因的实验方案

摘要

来源：Garone, M. G. 等. 利用PiggyBac载体将人诱导多能干细胞（iPSCs）转化为功能性脊髓和颅脑运动神经元。 J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了通过 PiggyBac 转座子系统转染人诱导多能干细胞（iPSCs），异位表达谱系特异性转录因子以生成运动神经元的操作流程。

方案

1. 生成可诱导的 NIL 和 NIP iPSC 细胞系

1. 细胞转染
   1. 用不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 PBS 洗涤细胞。
   2. 加入细胞解离试剂（见材料表）（35 mm 培养皿加 0.35 mL），在 37 °C 下孵育，直至细胞分散为单细胞。
   3. 分离完成（5–10 分钟）。
   4. 用 P1000 移液器轻轻吹打 3–4 次，完成细胞的彻底分离。
   5. 将细胞收集至 15 mL 离心管中，加入不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 PBS 至 10 mL，计数细胞。
   6. 离心收集 10⁶ 个细胞，重悬于 100 μl 电转缓冲液 R 中（包含于细胞电穿孔试剂盒中，见材料表）。
   7. 加入用于转染的质粒 DNA：4.5 μg 转座载体（epB-Bsd-TT-NIL 或 epB-Bsd-TT-NIP）和 0.5 μg piggyBac 转座酶质粒。
   8. 使用细胞电穿孔系统（见材料表）进行转染，按照制造商说明书设置以下参数：1,200 V 电压，30 ms 脉冲宽度，1 次脉冲。将细胞接种于添加了 10 μM Y-27632（ROCK 抑制剂，见材料表）的人源 iPSC 培养基中，置于 6 mm 基质包被的培养皿中培养。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	用于神经元细胞维持的无血清添加剂
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	运动神经元前体细胞冻存培养基
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	电生理溶液用化学品
Corning Matrigel hESC-合格基质	康宁	354277	从Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中重建的基底膜基质。用于诱导多能干细胞（iPSC）在塑料和玻璃载体上的黏附
CRYOSTEM ACF 冻存培养基	生物工业公司	05-710-1E	人诱导多能干细胞冻存培养基
Dispase	Gibco	17105-041	用于人iPSC温和解离的试剂
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	细胞培养基础培养基
多西环素	Sigma-Aldrich	D9891-1G	用于诱导 epB-Bsd-TT-NIL 和 epB-Bsd-TT-NIP 载体中转基因的表达
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	商用人类iPSC细胞系
GDNF	PreproTech	450-10	胶质细胞源性神经营养因子
Gibco 附加体质粒 hiPSC 细胞系	赛默飞世尔科技	A18945	商用人类iPSC细胞系
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	电生理溶液用化学品
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	11243217001	促进神经细胞在体外的贴附和生长
非必需氨基酸（NEAA）	赛默飞世尔科技	11140035	非必需氨基酸。用作细胞培养基的补充剂，以促进细胞生长并提高细胞存活率。
Neon 100 μL 型试剂盒	赛默飞世尔科技	MPK10096	细胞电穿孔试剂盒
Neon 转染系统	赛默飞世尔科技	MPK5000	细胞电穿孔系统
Neurobasal 培养基	赛默飞世尔科技	21103049	专为长期维持和促进神经元细胞群体成熟而设计的基础培养基  需要星形胶质细胞饲养层
NutriStem-XF/FF	生物工业公司	05-100-1A	人iPSC培养基
PBS Ca2+/毫克2+ 自由	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	不含钙、不含镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液
青霉素/链霉素	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	用于防止细菌污染细胞培养的青霉素/链霉素溶液。
Y-27632（ROCK抑制剂）	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	细胞通透性Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）选择性抑制剂。可提高诱导多能干细胞（iPSC）存活率