CRISPR串联体介导的多基因敲除：一种通过非同源末端连接途径在小鼠肠细胞中同时敲除多个基因的技术

摘要

来源：Merenda, A. 等，利用CRISPR串联体在小鼠小肠类器官中实现多基因敲除的实验方案。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频介绍了一种利用CRISPR串联体（CRISPR-concatemer）在培养的小鼠肠道类器官细胞中同时敲除多个基因的基因敲除技术。该方法可用于敲除致病基因，并阐明目标基因及其旁系同源基因的功能。

方案

1. CRISPR-concatemer 载体的 gRNA 设计

注意：本节旨在说明如何选择最佳的靶向策略，以及如何设计含有特定突出端的 gRNA 以用于 CRISPR-concatemer 载体。

1. 使用选定的CRISPR gRNA设计工具针对目标基因设计gRNA。示例见材料表。
   注意：当靶向一对旁系同源基因时，尽管可以为每个基因设计一个gRNA，但建议为每个基因设计两个gRNA，以提高实现双基因敲除的可能性（图1）。
2. 使用限制性酶切图谱工具确认gRNA序列中不含BbsI识别位点（示例见材料表）。
3. 为每条寡核苷酸添加特定的CRISPR-串联载体突出端，如表1所示。

2. 将gRNA克隆至CRISPR串联载体

1. 寡核苷酸的磷酸化与退火
   注意： 此步骤演示了如何对每个gRNA寡核苷酸的上链和下链进行退火，以及如何在单个反应中对其末端进行磷酸化。
   1. 按照以下说明，在冰上配制用于寡核苷酸磷酸化及上下链退火的反应混合液。
      注意： 所有寡核苷酸可混合至同一反应体系中；例如，对于含有4个gRNA串联的载体，将8条寡核苷酸混合。
   2. 对于3个串联体，使用3.0 μL gRNA上链（每种gRNA各1.0 μL；10 μM，1 μL/gRNA）、3.0 μL gRNA下链（每种gRNA各1.0 μL；10 μM，1 μL/gRNA）、2.0 μL T4 DNA连接酶缓冲液（10×）、1.0 μL T4多核苷酸激酶（T4 PNK），并加入H₂O₂加水至终体积为 20.0 μL。
   3. 用移液器充分混匀，然后在PCR仪中按照以下程序运行：37 °C 30分钟，95 °C 5分钟，以0.3 °C/分钟的速率降温至25 °C，4 °C保存。
2. BbsI型剪切反应
   注意： 在此步骤中，通过交替进行消化与连接循环，将预退火的gRNA寡核苷酸一步插入串联体载体的相应位置。
   1. 将反应混合物用无DNase/RNase水按1:100稀释，以制备3和4号gRNA串联体载体。
      注意： 当克隆2个gRNA串联体时，此步骤为 不 需要。
   2. 组装 Bbs将反应物在冰上混匀，具体操作步骤如下。设置一个仅包含载体的阴性对照。
   3. 使用100 ng CRISPR-concatemer载体、10.0 μL寡核苷酸混合物、1.0 μL含BSA的限制性内切酶缓冲液（10x）、1.0 μL DTT（10 mM）、1.0 μL ATP（10 mM）、1.0 μL BbsI，1.0 μL T7连接酶，和H₂加水至终体积为20.0 μL。
   4. 用移液器充分混匀，并在PCR仪中按照以下程序运行：运行 50 个循环 用于克隆3和4个gRNA串联体 25 个循环 对于2个gRNA串联体，均在37 °C孵育5分钟，21 °C孵育5分钟， 保持在 37 °C 反应 15 分钟，然后 4 °C 保存
3. 外切酶处理
   注意： 强烈建议执行此步骤，因为它可去除线性化DNA的任何残留，从而提高克隆效率。
   1. 处理 Bbs使用DNA外切酶进行洗牌反应（参见 材料表如下所述。
   2. 从上一步中取 11.0 μL 连接反应混合物（2.2.3），加入1.5 μL外切核酸酶缓冲液（10×）、1.5 μL ATP（10 mM）、1.0 μL DNA外切核酸酶，加水至总体积为15.0 μL。37 °C孵育30分钟，随后70 °C孵育30分钟。
      注意： 此步骤可去除混合物中残留的线性化DNA，从而提高克隆效率。
   3. 使用2 μL反应混合物转化至感受态细胞中 E. coli 通过热激转化细菌。
      ​注意： 或者，反应物可在 -20 °C 下保存长达一周。

3. 通过电穿孔法转染肠道类器官

注意：请注意，本实验步骤基于Fujii et al. 于2015年发表的实验方案，并针对小鼠小肠类器官培养进行了优化调整。

1. 电穿孔前
   注意： 本部分介绍在电穿孔前如何通过去除培养基中的所有抗生素和条件培养基来制备小鼠肠道类器官，以避免电穿孔过程中可能产生的毒性作用。
   1. 在转染程序的第0天，以1:2的比例传代类器官。
      ​注意： 肠道类器官培养可通过按照既定方案进行隐窝分离获得。请参见 表2 所有培养基成分。
      1. 进行电穿孔传代类器官时，每次转染至少接种48孔板的6个孔。
      2. 将类器官接种于20 μL基底膜基质液滴中，并在WENR + Nic培养基（Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + Nicotinamide）中于37 °C、5% CO₂条件下培养₂ 在加湿培养箱中（如前所述）。
   2. 第2天，将培养基更换为250 μL EN（EGF + Noggin）+ CHIR99021（糖原合成酶激酶-3抑制剂）+ Y-27632（ROCK抑制剂），不添加抗生素（参见 表2).
      ​注意： 在所有步骤中，向48孔板的每个孔中加入的培养基量均为250 μL。
   3. 第3天，将类器官培养基更换为EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25% v/v 二甲基亚砜（DMSO），不添加抗生素。
2. 细胞的制备
   注意： 本文介绍了如何通过机械和化学解离方法将类器官破碎成小的细胞簇。这些步骤对实验操作的成功至关重要。
   1. 第4天，使用1 mL移液器枪头破坏基底膜基质小滴，将类器官转移至1.5 mL离心管中。将48孔板中四个孔的内容物合并至同一离心管中。
   2. 使用P200移液器反复吹打约200次，将类器官机械性地破碎成小片段。室温下以600 × g离心5分钟。
   3. 吸除培养基，将沉淀重悬于1 mL细胞培养级重组蛋白酶中（见材料表）。在37 °C孵育最多5分钟，随后取50 μL样品滴加至倒置光学显微镜下，使用4倍物镜观察。
      注意： 理想的细胞簇包含10-15个细胞，因为这可以提高电穿孔后的细胞存活率。
   4. 将细胞悬液转移至低吸附的15 mL离心管中，并通过加入9 mL不含抗生素的基础培养基终止消化反应（参见 表 2）。在室温下以600 × g离心5分钟，然后弃去上清液，并将沉淀重悬于1 mL低血清培养基中（参见 材料表).
   5. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并使用至少 1 x 10⁵ 每次电穿孔反应的细胞数。向15 mL离心管中加入9 mL低血清培养基，在室温下以400 × g离心3分钟。
3. 电穿孔
   注意： 以下部分介绍了如何进行电穿孔操作以及如何使类器官在电穿孔后恢复。
   1. 移除所有上清液，并将沉淀重悬于电穿孔溶液中（参见 材料表）。向细胞悬液中加入总共10 μg DNA，并加入电穿孔溶液至终体积为100 μL，将细胞-DNA混合物置于冰上。使用CRISPR-串联载体与Cas9表达质粒联合例如， Addgene #41815）按1:1比例混合。
      注意： 加入的DNA总体积应小于或等于总反应体积的10%。
   2. 加入含有GFP质粒的独立转染混合物，以评估转染效率（例如， pCMV-GFP，Addgene #11153，或任何通用的GFP表达质粒。
   3. 将细胞-DNA混合物加入电穿孔比色皿中，并将其放入电穿孔仪腔室。按下电穿孔仪上的相应按钮测量阻抗，确保其在0.030–0.055 kΩ范围内。根据所示设置进行电穿孔操作 表3.
      注意： 如果阻抗值超出允许范围，请调整比色皿中的溶液体积。
   4. 向电穿孔缓冲液 + Y-27632 中加入 400 μL 至比色杯，然后全部转移至 1.5 mL 离心管中。室温孵育 30 分钟以使细胞恢复，随后在室温下以 400 × g 离心 3 分钟。
   5. 移除上清液，将沉淀重悬于每孔20 μL基底膜基质中。在48孔板中每孔接种约1 × 10⁴至1 × 10⁵个细胞，并加入含EN、CHIR99021、Y-27632及1.25% v/v DMSO的培养基。于37 °C孵育。
   6. 第5天，更换为含CHIR99021和Y-27632的EN培养基，并通过观察GFP表达情况检测转染效率（图2将类器官置于37 °C培养，并在2天后更换EN + CHIR99021 + Y-27632培养基。
   7. 第9天，更换为WENR + Nic + Y-27632培养基，于37 °C培养。
      注意： Y-27632 可在 7–10 天后（第 16–19 天）去除。

	胶带 1	胶带 2	胶带 3	胶带 4
序列 (5′-3′)	CACCGG[gRNA1]GT	ACCGG[gRNA2]G	CCGG[gRNA3]	ACACCGG[gRNA4]GTT
序列 (5′-3′)	TAAAAC[RC-gRNA1]CC	AAAAC[RC-gRNA2]C	AAAC[RC-gRNA3]	CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG

表1：CRISPR-concatemer载体各盒式元件的突出端序列。

基础培养基		备注
4 °C 保存 4 周
细胞培养基	500 mL	参见材料表
L-谷氨酰胺	100x 5 mL
缓冲剂 1 M	5 mL	参见材料表
青霉素-链霉素	100x 5 mL
WENR + Nic（Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + 烟酰胺）
4 °C 保存 2 周
基础培养基	最多 50 mL
神经细胞无血清添加剂（50x）	1 mL	参见材料表
神经细胞无血清添加剂（100x）	500 μL	参见材料表
N-乙酰半胱氨酸（500 mM）	125 μL
小鼠 EGF（100 μg/mL）	25 μL
小鼠 Noggin（100 μg/mL）	50 μL
R-spondin 条件培养基	5 mL
Wnt3a 条件培养基	25 mL
烟酰胺（1 M）	250 μL
EN + CHIR + Y-27632（EGF + Noggin + CHIR + Y-27632）
4 °C 保存 2 周
不含青霉素-链霉素的基础培养基	最多 20 mL
神经细胞无血清添加剂（50x）	400 μL	参见材料表
神经细胞无血清添加剂（100x）	200 μL	参见材料表
N-乙酰半胱氨酸（500 mM）	50 μL
小鼠 EGF（100 μg/mL）	10 μL
小鼠 Noggin（100 μg/mL）	20 μL
Y-27632（10 μM）	20 μL
CHIR99021（8 μM）	10 μL
EN（EGF + Noggin）
4 °C 保存 4 周
基础培养基	最多 50 mL
神经细胞无血清添加剂（50x）	1 mL	参见材料表
神经细胞无血清添加剂（100x）	500 μL	参见材料表
N-乙酰半胱氨酸（500 mM）	125 μL
小鼠 EGF（100 μg/mL）	25 μL
小鼠 Noggin（100 μg/mL）	50 μL

表2：类器官培养基成分。

	电穿孔脉冲	转移脉冲
电压	175V	20V
脉冲时长	5 msec	50msec
脉冲间隔	50msec	50msec
脉冲次数	2	5
衰减率	10%	40%
极性	+	+/-

表3：电穿孔设置。

结果

图 1：含 4 个表达盒的 CRISPR-串联体示意图。 四个 gRNA-串联体载体的示意图，每个 400 bp 的表达盒依次包含 U6 启动子、两个反向重复的 BbsI 位点（也标记为 BB）以及 gRNA 支架结构。在洗牌反应过程中，BbsI 位点被具有匹配突出端的 gRNA 片段取代，因而被消除。用于检测 gRNA 寡核苷酸正确插入的测序引物结合位点由蓝色箭头表示。Fwd = 正向引物，Rev = 反向引物，Link 1/2/3 = 连接区 1/2/3。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
优化的CRISPR设计工具 	Feng Zhang group 		CRISPR gRNA设计工具；http://crispr.mit.edu/
Webcutter 2.0 			限制性酶切图谱分析工具；http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/
T4 PNK（多核苷酸激酶） 	New England Biolabs 	M0201L
T4 DNA连接酶缓冲液 	New England Biolabs 	M0202S
T7 DNA连接酶 	New England Biolabs	 M0318L
DTT（二硫苏糖醇） 	Promega 	P1171
ATP（三磷酸腺苷） 	New England Biolabs 	P0756S
FastDigest BbsI（BpiI） 	Thermo Fisher 	FD1014
Tango缓冲液（含BSA的限制性内切酶缓冲液）	Thermo Fisher 	BY5
BglII 	New England Biolabs 	R0144
EcoRI 	New England Biolabs 	R0101
质粒安全外切酶 	Cambio 	E3101K
热循环仪 	Applied biosystems 	4359659
10G感受态大肠杆菌 	Cambridge Bioscience 	60108-1
高级DMEM/F12（细胞培养基）	Invitrogen 	12634-034
Glutamax（L-谷氨酰胺） 	100x Invitrogen 	35050-068
HEPES 1 M（缓冲剂） 	Invitrogen 	15630-056
青霉素-链霉素 100x 	Invitrogen 	15140-122
B27添加剂（神经元细胞无血清添加剂）50x	Invitrogen 	17504-044
N2添加剂（神经元细胞无血清添加剂）100x	Invitrogen 	17502-048
N-乙酰半胱氨酸 500 mM 	Sigma-Aldrich 	A9165-5G
小鼠EGF 500 μg/mL 	Invitrogen Biosource 	PMG8043
小鼠Noggin 100 μg/mL 	Peprotech	 250-38
烟酰胺 1 M 	Sigma 	N0636
R-Spondin条件培养基 	n.a. 	n.a. 	由HEK293细胞自行制备，详情参见Sato和Clevers 2013
Wnt条件培养基	n.a. 	n.a. 	由HEK293细胞自行制备，详情参见Sato和Clevers 2014
Y-27632 10 μM 	Sigma-Aldrich 	Y0503-1MG
标准BD Matrigel基质 	BD Biosciences	356231
48孔板 	Greiner Bio One 	677980
CHIR99021 	Sigma-Aldrich 	A3734-1MG
IWP-2 	Cell Guidance Systems 	SM39-10
TrypLE（重组蛋白酶）	 Invitrogen 	12605-010
Opti-MEM（低血清培养基）	Life technologies	 51985-034
电穿孔比色皿（2 mm间隙） 	NepaGene 	EC-002S
低吸附15 mL离心管 	Sigma-Aldrich 	CLS430791
Bürker’s计数板 	Sigma-Aldrich	 BR719520-1EA
NEPA21超级电穿孔仪 	NepaGene 	联系供应商
Protein LoBind低吸附离心管	Thermo Fisher 	10708704
BTXpress电穿孔缓冲液 	Harvard Apparatus 	45-0805
DMSO（二甲基亚砜）	 AppliChem	 A3672