将核酸导入贴壁培养细胞的珠粒加载法：一种将编码荧光蛋白的质粒导入贴壁哺乳动物细胞的技术

摘要

来源：Cialek, C. A. 等. 将蛋白质和核酸通过微珠载入贴壁人源细胞. J. Vis. Exp. (2021)。

在本视频中，我们描述了使用微珠载入法将核酸导入贴壁哺乳动物细胞的操作步骤。

方案

1. 磁珠加载细胞

注意：如有需要，用磷酸盐缓冲液（PBS）短暂清洗细胞，然后加入 2 mL 最佳培养基。至少孵育 30 分钟。

1. 配制含有目标质粒、蛋白质和/或颗粒的溶液，体积为 3–8 µL。根据实验需求，每种质粒使用约 1 µg（0.1–1 pmol），蛋白质使用约 0.5 µg（0.01 nmol）。蛋白质操作应使用低吸附管，以避免其吸附在管壁上残留。用 PBS 将溶液体积补足至至少 3 µL，并根据待转染细胞区域的大小调整体积，确保溶液能够完全覆盖该区域（即腔室的微孔，见图 1B）。
2. 通过反复吹打和/或轻弹管壁充分混匀溶液。在台式微量离心机中短暂离心，使溶液全部沉降至管底。
3. 将微珠加载溶液和细胞腔室转移至组织培养超净台内。后续所有操作均应在超净台中以无菌技术进行。
4. 移除细胞培养基，并暂时将其储存于无菌离心管中。小心吸除腔室边缘的全部培养基，将腔室倾斜约 45° 角，吸除中心微孔中残留的液滴。在去除培养基过程中，注意避免移液枪头接触玻璃表面，以防细胞脱落或损伤。操作应迅速，避免细胞长时间暴露于干燥环境中。
5. 将微珠加载溶液轻柔地滴加至腔室中央的玻璃微孔表面。可选步骤：在不使腔室完全干燥的前提下，轻轻摇动孵育约 30 秒。
6. 在细胞表面轻柔地分散一层玻璃....

结果

图1：微珠加载装置、技术及时间线

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 厘米细胞培养皿	VWR	82050-916	用于细胞培养
35 毫米细胞培养皿	Falcon	353001	用于构建微珠转染装置
Attofluor 细胞培养腔室	Thermo Fisher Scientific	A7816	用于构建定制的微珠转染装置
DMEM，高糖，无谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	11960069	用于常规细胞培养
玻璃底培养皿，35 毫米，#1.5，玻璃直径 14 毫米	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	将细胞接种于这些腔室中用于成像
玻璃微珠，酸洗，≤106 µm	Millipore Sigma	G4649	撒在细胞上以实现质粒 DNA 和蛋白质的微珠转染
磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Fisher Scientific	AM9625	无菌 1X PBS 工作液
无酚红 DMEM	Thermo Fisher Scientific	31053036	成像前用于细胞培养
Opti-MEM 低血清培养基	Thermo Fisher Scientific	31985070	微珠转染前孵育细胞的最佳培养基（可选步骤）