基于纳米刀的核酸递送技术：通过类病毒颗粒将Cas9-sgRNA复合物递送至靶细胞的方法

摘要

来源：Mangeot, P. E., 等. 通过病毒样颗粒（“纳米刀”）递送Cas9/sgRNA核糖核蛋白复合物至永生化细胞和原代细胞。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了一种基于纳米刀片（nanoblade）的技术，用于将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物递送至靶细胞内以实现基因组编辑。纳米刀片是类似病毒的颗粒，但不具备在邻近细胞中复制和感染的能力，因此非常适合用于生物材料和纳米材料的快速、剂量依赖性运输。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. sgRNA 设计与克隆

注意sgRNA 的设计指南可从多个来源获取，例如 https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing 或 Hanna 与 Doench 的相关文献。

1. 设计好20个核苷酸的sgRNA序列后，订购以下单链DNA寡核苷酸：
   1. 正向链：5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'（N对应靶向位点序列，不含原间隔序列邻近基序（PAM））
   2. 反向链：5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc 3'（N对应靶向位点的反向互补序列，不含PAM序列）
      注意：订购寡核苷酸时无需特殊修饰（无需5'磷酸化）。
2. 在0.2 mL聚合酶链式反应（PCR）管中，将两条DNA寡核苷酸进行退火杂交，反应体系包括：5 µL退火缓冲液（500 mM NaCl；100 mM Tris-HCl；100 mM MgCl₂；10 mM DTT；pH 7.9，25 °C），每条DNA寡核苷酸各1 µL（100 µM水溶液），以及42 µL水。
3. 在PCR仪中，将样品于95 °C孵育15秒，然后以0.5 °C/s的降温速率降至20 °C。之后可置于室温或-20 °C保存。
   注意：本步骤可暂停操作。
4. 在总体积为50 µL的反应体系中，使用10单位BsmBI-v2限制性内切酶在55 °C下消化10 µg的BLADE或SUPERBLADE sgRNA表达质粒，反应时间3小时。
   注意：经酶切后的载体应释放出一个约1.9 kb的DNA插入片段和另一个约3.3 kb的DNA片段。
5. 将限制性酶切反应产物上样至含5 µg/mL溴化乙锭（或更安全的替代性DNA凝胶染料）的1%琼脂糖凝胶中。
   注意：操作溴化乙锭时应佩戴适当的防护装备，因其可能引起遗传缺陷。
   1. 在波长为312 nm的紫外（UV）透射仪上（以避免DNA损伤），切下凝胶中的3.3 kb DNA片段，并将其放入1.5 mL微量离心管中。
      注意：操作溴化乙锭及在紫外透射仪上工作时，应佩戴适当的防护装备（手套和防紫外线护目镜）。
   2. 使用专用的DNA凝胶回收试剂盒（见材料表）从含有3.3 kb DNA片段的凝胶切片中提取DNA。使用分光光度计测定纯化后DNA的浓度。
      ​注意：本步骤可暂停操作。
6. 将第1.2步中退火杂交得到的正向与反向DNA寡核苷酸连接至第1.5.2步中经BsmBI酶切并凝胶纯化的BLADE或SUPERBLADE载体。连接反应体系如下：加入2 µL T4 DNA连接酶缓冲液、50 ng凝胶纯化的载体（来自第1.5.2步）、1 µL退火后的DNA寡核苷酸（来自第1.2步），加水至总体积19 µL，最后加入1 µL T4 DNA连接酶。于25 °C孵育反应10分钟。
   1. 将连接产物转化至感受态细菌中（见材料表）。将转化后的细菌涂布于氨苄青霉素Luria Bertani琼脂平板，37 °C过夜培养。
   2. 从琼脂平板上挑选数个独立菌落进行质粒小量提取（见材料表），并使用U6正向引物（5' GACTATCATATGCTTACCGT 3'）进行Sanger测序，以确认sgRNA可变序列的正确连接。
      ​注意：也可使用其他sgRNA表达质粒，但其不能编码Cas9蛋白，以免干扰Nanoblade的生产。

2. 质粒制备

1. 进行所有所需质粒的大提制备（参见材料表），并将其分装为每份10 µg、浓度1 µg/mL的溶液，于-20 °C保存。避免质粒反复冻融；每份分装液最多使用两次后即弃用。

3. 纳米刀制备

1. 第1天，在10 cm细胞培养皿中接种3.5至4 × 10⁶个HEK293T细胞（参见材料表），加入10 mL含高糖、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、10%胎牛血清（FBS）及青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。轻轻前后移动10 cm培养皿，再左右移动（重复此操作5次），使细胞在培养皿内均匀分布。将细胞置于37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中孵育。
   注意：所有涉及培养细胞和Nanoblades的操作均应在细胞培养超净工作台内进行，以避免污染。
2. 第2天：质粒转染
   1. 接种24小时后，细胞应达到70–80%融合度（图1A）。转染前，更换为10 mL新鲜DMEM培养基，含高糖、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺和10% FBS（可省略青霉素和链霉素，但非必须）。
      注意：此步骤中，细胞不应完全融合，否则可能降低转染效率及病毒颗粒产量。
   2. 为每个10 cm培养皿，在1.5 mL离心管中准备以下质粒量：0.3 µg pCMV-VSV-G、0.7 µg pBaEVRless、2.7 µg MLV Gag/Pol、1.7 µg BIC-Gag-Cas9、4.4 µg编码克隆sgRNA的BLADES或SUPERBLADES质粒（若使用两个sgRNA，则各加2.2 µg）。
   3. 加入500 µL转染缓冲液（参见材料表），涡旋10秒，然后离心1秒。加入20 µL转染试剂（参见材料表），涡旋管子1秒，再离心1秒。
   4. 室温孵育10分钟，使用P1000移液器将全部溶液逐滴加入含DMEM培养基的细胞中。轻轻前后移动10 cm培养皿，再左右移动（重复此操作5次），使转染试剂在细胞表面均匀分布。将细胞置于37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中孵育至少40小时。
      注意：如有需要，可在转染后4小时更换培养基。
3. 第3天，在显微镜下观察转染细胞的形态。
   注意：生产细胞将开始融合，这是由于融合性病毒包膜蛋白表达所致，属于正常现象（图1B,C）。
4. 第4天：收集Nanoblades
   注意：转染至少40小时后，细胞会因融合性病毒包膜蛋白的表达而相互融合，有时甚至完全从培养皿表面脱落（图1D）。
   1. 使用10 mL移液器收集9 mL培养上清液。
      注意：Nanoblades是病毒样颗粒（VLPs），可将Cas9蛋白及其结合的sgRNA递送至原代细胞及体内。尽管其不含遗传物质，不被视为转基因生物，但仍可诱导基因改变。因此，操作时必须谨慎，避免与操作者接触（尤其是当其被设计靶向抑癌基因时）。建议遵循当地关于逆转录病毒载体操作的安全指南，并在BSL-2级实验室中进行VLP制备和转导实验。Nanoblades可用70%乙醇或0.5%次氯酸钠灭活。建议将所有塑料废弃物（移液枪头、组织培养皿、离心管等）用0.5%次氯酸钠处理至少10分钟，以灭活Nanoblades。
   2. 将收集的上清液在500 × g条件下离心5分钟，去除细胞碎片，并小心回收上清液，避免扰动细胞沉淀。
      ​注意：若Nanoblades将用于原代细胞，可使用0.45 µm或0.8 µm滤器过滤上清液。需注意，此步骤会显著降低Nanoblades滴度，因大量颗粒会被滤膜截留。
   3. 在4 °C条件下，使用摆桶转子在4,300 × g下离心过夜（12–16小时），或在超速离心机中于209,490 × g下离心75分钟，以沉淀Nanoblades（参见材料表）。
      ​注意：若靶细胞可在DMEM中生长，则可在步骤3.4.2后直接使用上清液进行孵育，无需浓缩Nanoblades。
5. 第5天：Nanoblades的重悬与保存
   1. 离心后，缓慢吸除上清液，用100 µL预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬白色沉淀。用封口膜封住管口，在4 °C轻柔振荡孵育1小时，然后通过反复吹打使沉淀充分重悬。
      注意：重悬时可能出现白色粘稠物质，此为正常现象，不会显著影响转导效率。
   2. 若计划在四周内使用Nanoblades，可将其保存于4 °C。否则，应使用液氮速冻后于-80 °C保存。
      ​注意：操作液氮时应佩戴护目镜和低温手套。速冻并保存于-80 °C会导致Nanoblades活性显著下降。此外，解冻后的Nanoblades不应再次冷冻。本方案可在此处暂停。

4. 蔗糖垫上纳米刀的浓缩

注意：作为过夜离心或超速离心（步骤 3.4.3）的替代方法，可使用蔗糖垫浓缩Nanoblades。该方法可获得纯度更高的Nanoblades组分，但回收总量较低。

1. 在1x PBS中配制10%的蔗糖溶液（质量/体积），并通过0.2 µm针筒滤器过滤（参见材料表）。
2. 开始在蔗糖垫上浓缩Nanoblades。
   1. 将9 mL含VLP的样品（来自步骤3.4.3）加入超速离心管中（参见材料表）。使用3 mL注射器和套管，将2.5 mL 10%蔗糖溶液缓慢铺在样品下方，注意避免混合含VLP的样品与蔗糖溶液。
   2. 或者，先将2.5 mL 10%蔗糖溶液加入超速离心管中（参见材料表）。倾斜离心管，使用低速移液器缓慢加入9 mL含VLP的样品（来自步骤3.4.3），并在操作过程中逐渐将离心管竖直。
3. 在4 °C条件下，以209,490 × g 的离心力在超速离心机中离心90分钟。
   注意：该技术可调整为在4,300 × g 的较低离心力下过夜离心。
4. 离心后，小心移除上清液，并将离心管倒置放在滤纸上以去除残留液体。1分钟后，加入100 µL 1x PBS，将离心管置于4 °C，在振荡仪上的离心管架中加盖Parafilm膜，孵育1小时（参见材料表），然后通过上下吹打重悬沉淀。
   ​注意：本实验方案可在此处暂停。

通过点印迹法监测Cas9在纳米刀中的装载情况

1. 通过将1体积含有非离子型表面活性剂的裂解缓冲液（参见材料表）加入4体积的1×PBS中，配制稀释缓冲液。取2 µL浓缩的Nanoblades加入50 µL稀释缓冲液中，短暂涡旋混匀，然后将25 µL该混合液转移至另一新管中，其中已含有25 µL稀释缓冲液。重复此操作，共制备4管Nanoblades的系列稀释液（每次2倍稀释）。
2. 对于标准对照，将2 µL重组Cas9核酸酶（参见材料表）加入50 µL稀释缓冲液中，短暂涡旋混匀，随后进行8次连续稀释（每次2倍稀释）。
3. 使用多通道移液器，小心地将每种VLP稀释液各2.5 µL以及每种标准品各2.5 µL点样于硝酸纤维素膜上（体积过大可能导致斑点重叠）。
   注意：也可使用经甲醇处理的聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。
4. 待颗粒完全吸附至膜上后，用含非离子型表面活性剂（TBS-T）并补充5%（w/v）脱脂奶粉的1×Tris缓冲盐水在室温下封闭膜45分钟。
   注意：此步骤后可暂停实验流程，将膜置于4 °C的1×TBS-T中保存。
5. 弃去含脱脂奶粉的1×TBST，将膜在4 °C下与Cas9-辣根过氧化物酶抗体（按1/1000比例溶于1×TBST并含5%脱脂奶粉）孵育过夜。用TBS-T洗涤膜3次，随后使用增强型化学发光底物试剂盒显影信号。
6. 使用凝胶成像系统配套的专用软件或ImageJ软件，对Nanoblades及重组Cas9标准品稀释系列的斑点强度进行定量分析。建立斑点强度与Cas9浓度之间的线性曲线，并根据该曲线函数推算各制备样品中的Cas9含量。
   注意：重组Cas9蛋白对照在标准稀释系列中最浓样品中可能导致信号饱和（图2）。因此，在拟合线性曲线时，若未稀释样品（有时还包括前几次稀释样品）的读数不在已知Cas9点样浓度的线性范围内，则应将其剔除。同样，在推算Nanoblades样品中Cas9含量时，仅应使用处于标准曲线线性范围内的读数。

6. 使用Nanoblades转导靶细胞（12孔板中转导操作步骤）

1. 在12孔板中，每孔接种100,000–200,000个细胞（原代或永生化贴壁细胞），加入1 mL相应的细胞培养基。在转导前，让细胞充分贴附于孔板表面。
2. 在1.5 mL微量离心管中，加入5–20 µL浓缩的Nanoblades（来自步骤3.5.1或4.4），再加入500 µL细胞培养基，使用P1000移液器反复吹打混匀。吸除细胞培养孔中的原有培养基，替换为500 µL上述Nanoblades混合液。
   注意：每种细胞类型的转导条件均需优化。应使用尽可能小的培养基体积（同时避免目标细胞干燥），以保持Nanoblades的高浓度。贴壁细胞必须在贴附于孔板的状态下直接进行转导（切勿在悬浮状态下转导，否则会显著降低转导效率）。某些细胞可耐受较长时间的Nanoblades暴露（24–48 h），而另一些细胞则非常敏感，可能出现小合胞体。在此情况下，Nanoblades与细胞共孵育时间应控制在4–6 h，之后即更换培养基。对于悬浮培养的细胞，离心增强转导（spinoculation）也可提高转导效率。某些佐剂（如阳离子聚合物，参见材料表）在部分细胞类型中亦可提升转导效率。
3. 在含Nanoblades的少量培养基中孵育细胞4–6 h后，将培养基体积补充至正常量（若使用12孔板，则补至1 mL），或在细胞对VLPs敏感的情况下更换为新鲜培养基。
   注意：含有Nanoblades的细胞培养基在弃置前必须用0.5%次氯酸钠处理10 min以灭活。操作次氯酸钠时应佩戴手套和防护眼镜。若Nanoblades引起细胞死亡，应调整使用剂量和总暴露时间以降低细胞死亡率。

结果

图1：Nanoblade生产过程中生产细胞的形态学特征。 （A）铺板后24小时、融合度为70-80%的HEK293T细胞。（B 和 C）转染后24小时的HEK293T细胞形态。（D）转染后40小时的HEK293T细胞形态。比例尺 = 400 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
13.2 mL，薄壁聚丙烯管，14 x 89 mm - 50支装	Beckman Coulter Life Sciences	331372	用于Nanoblades纯化的超速离心管
Amersham Protran Premium 蛋白质印迹膜，硝酸纤维素膜	Merck	GE10600004	用于定量纯化Nanoblades中Cas9水平的硝酸纤维素膜
BIC-Gag-CAS9	Addgene	119942	编码GAG（F-MLV）-CAS9(sp)融合蛋白。可在生产细胞中与过表达的gRNA(s)及适当的包膜蛋白共同作用，产生GAG-CAS9类病毒颗粒
BICstim-Gag-dCAS9-VPR	Addgene	120922	编码GAG-dCAS9-VPR融合蛋白，用于靶向转录激活
BLADE	Addgene	134912	用于在Nanoblades系统中克隆sgRNA序列的空骨架载体
BsmBI-v2	New England Biolabs	R0739S	限制性内切酶，用于消化BLADE和SUPERBLADES载体以进行sgRNA克隆
Cas9 (7A9-3A3) 小鼠单克隆抗体（HRP偶联）#97982	Cell Signaling Technology	97982S	用于点印迹法检测Cas9的抗Cas9抗体
Cas9 核酸酶，S. pyogenes	New England Biolabs	M0386T	重组Cas9蛋白，用作Nanoblades中Cas9载量绝对定量的参考标准
溴化乙锭溶液（10 mg/mL，溶于H2O）	Sigma-Aldrich	E1510-10ML	用于琼脂糖凝胶染色及DNA可视化
Fisherbrand Wave Motion 摇床	Fisher Scientific	88-861-028	离心后重悬Nanoblades的振荡平台
gelAnalyzer			http://www.gelanalyzer.com；用于酶切后条带强度的定量分析
Gesicle Producer 293T	Takara	632617	Nanoblades生产细胞系
Gibco DMEM，高糖，含丙酮酸钠	ThermoFisher Scientific	41966052	Gesicle Producer 293T细胞的培养基
jetPRIME 转染试剂盒（适用于DNA及DNA/siRNA）	Polyplus	POL114-15	用于在Gesicle Producer 293T细胞中生产Nanoblades的转染试剂
Millex-AA，0.80 µm，针头滤器	Millipore	SLAA033SS	在浓缩Nanoblades前去除细胞碎片的针头滤器
Millex-GS，0.22 µm，针头滤器	Millipore	SLGS033SS	用于蔗糖垫溶液灭菌的针头滤器
Millex-HP，0.45 µm，聚醚砜，针头滤器	Millipore	SLHP033RS	在浓缩Nanoblades前去除细胞碎片的针头滤器
Monarch DNA凝胶回收试剂盒	New England Biolabs	T1020L	用于BsmBI酶切后纯化pBLADES或pSUPERBLADES质粒片段的DNA凝胶回收试剂盒
NEB Stable 感受态E. coli（高效率）	New England Biolabs	C3040I	用于质粒转化与扩增的感受态细菌
NucleoBond Xtra Midi 试剂盒（用于转染级质粒DNA）	Macherey-Nagel	740410.5	从培养细菌中纯化质粒DNA的大提试剂盒
Nucleospin 基因组DNA提取试剂盒	Macherey-Nagel	740952.5	从转导细胞中提取基因组DNA
NucleoSpin 质粒DNA小提试剂盒	Macherey-Nagel	740588.5	从培养细菌中纯化质粒DNA的小提试剂盒
NucleoSpin 组织DNA小提试剂盒（适用于细胞与组织）	Macherey-Nagel	740952.5	基因组DNA提取试剂盒
Optima XE-90	Beckman Coulter Life Sciences	A94471	超速离心机
pBaEVRless	Els Verhoeyen (Inserm U1111)	个人请求需发送至：els.verhoyen@ens-lyon.fr	狒狒内源性逆转录病毒Rless包膜蛋白，见于Girard-Gagnepain A. 等人发表于Blood 124, 1221–1231 (2014) 的研究
pBS-CMV-gagpol	Addgene	35614	编码小鼠白血病病毒gag和pol基因
pCMV-VSV-G	Addgene	8454	用于生产慢病毒和MuLV逆转录病毒颗粒的包膜蛋白
磷酸盐缓冲液（PBS）	ThermoFisher Scientific	14200091	10X PBS，需用Millipore水稀释
Polybrene 转染试剂	Millipore Sigma	TR-1003-G	阳离子聚合物，可增强特定哺乳动物细胞中逆转录病毒转导效率。也可促进寡脱氧核苷酸（ODN）依赖病毒进入，用于同源定向修复
蔗糖，分子生物学级，≥99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	S0389-5KG	用于制备超速离心纯化Nanoblades时的蔗糖垫
SUPERBLADE5	Addgene	134913	用于在Nanoblades系统中克隆sgRNA序列的空骨架载体（经Chen B等人2013年研究优化，以提高基因组编辑效率）
SuperSignal West Dura 增强型化学发光底物	ThermoFisher Scientific	34076	用于Cas9点印迹的增强型化学发光（ECL）HRP底物
SW 41 Ti 摆动桶转子	Beckman Coulter Life Sciences	331362	超速离心用转子
SYBR Safe DNA凝胶染料	ThermoFisher Scientific	S33102	溴化乙锭的替代品，用于琼脂糖凝胶染色及DNA可视化
T4 DNA连接酶	New England Biolabs	M0202S	DNA连接酶，用于将BLADE或SUPERBLADES载体与对应sgRNA可变区的双链DNA寡核苷酸连接
含Triton的裂解缓冲液	Promega	E291A	用于裂解Nanoblades并实现Cas9定量的裂解缓冲液
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416	用于TBST缓冲液的配制