蚊虫胚胎显微注射：一种将外源DNA递送至胚胎卵黄的技术 Anopheles gambiae 生成生殖系突变

摘要

来源：Carballar-Lejarazú, R. 等 显微注射法 Anopheles gambiae 胚胎 J. Vis. Exp. (2021).

在本视频中，我们通过胚胎显微注射技术，将基因驱动载体导入冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）的胚胎中。该操作可通过同源重组将导入的DNA载体整合到生殖细胞中，从而产生基因改造的蚊群。

方案

1. 胚胎显微注射

1. 使用微注射加样头将 2 µL DNA 混合物（质粒 DNA 浓度为 300–400 ng/µL）注入注射针中。将注射针插入针夹，并连接自动压力泵管路（图 1）。
2. 重要提示：调整注射针角度，使其与载玻片平面成 15° 角（图 1）。
3. 通过轻轻触碰冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）的第一枚卵来打开针尖，并将针尖插入卵的后极，深度不超过 10 µm。成功的注射会导致卵内细胞质出现轻微移动。
4. 使用显微镜同轴载物台控制装置移动至下一枚卵，继续注射。
   1. 为确保针尖保持通畅且未堵塞，每次进入另一枚胚胎前应先按下“注射”按钮，并观察针尖开口处形成的小液滴。
   2. 若针尖发生堵塞，按下“清除”按钮以疏通针尖，并重复液滴观察测试。若针尖开口略有扩大，应根据需要调整压力，以确保液滴大小保持较小。
   3. 每根针可注射约 40–50 枚卵。
      注意：务必始终保持滤纸湿润。对注射针保持足够的反向压力以维持通畅。若针尖无法疏通，则必须更换新针。使用具备同轴控制功能以实现载物台水平移动的显微镜，可使胚胎定位、针尖插入和注射操作更加便捷（图 2）。
5. ....

结果

图 1： 显微注射过程中注射针的位置。 A) 注射平台的广角视图。B,C) 将注射针定位，使排列整齐的胚胎与注射针形成 15° 的夹角。不要将固定注射针的显微注射仪机械臂显著抬高至显微镜载物台以上，以确保注射针与盛有胚胎的载玻片之间具有合适的角度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x 显微注射缓冲液	-	-	1 mM NaHPO4 缓冲液，pH 6.8，50 mM KCl
印迹膜（Zeta-Probe GT 基因组验证印迹膜）	Bio-Rad		整齐笔直地切成 2×1 cm 的片状
去离子水或双蒸水（ddH20）	Mili-Q		装入洗瓶中
解剖显微镜	Leica	Leica MZ12	用于胚胎排列
玻璃容器	Pyrex	No. 3140	125 × 65
载玻片	Fisher Brand	No. 12-549-3	75×26 mm
显微注射仪	Sutter Instrument		XenoWorks 数字显微注射仪
微量移液器加样头（Microloader）	Eppendorf		20 µL Microloader epT.I.P.S.
显微操作仪	Sutter Instrument		XenoWorks 显微操作仪
微量移液器	Rainin		20 µL
显微镜	Leica	DM 1000 LED 或 M165 FC	用于显微注射
尼龙筛网
毛笔	Blick	No. 05831-7040	细头，4/0 号
培养皿			塑料材质（60×15 mm，90×15 mm）