水动力基因递送：一种技术方法 体内 通过尾静脉注射将外源DNA转染入小鼠肝细胞

摘要

来源：Hubner, E. K. 等人， 组成型与诱导型基因表达系统 体内 通过水动力尾静脉注射法修饰小鼠肝细胞 视频实验杂志 (2018).

本视频介绍了通过水动力尾静脉注射法对小鼠肝细胞进行体内遗传转染的技术。该转染系统可在肝细胞中实现外源基因的长期表达。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会的审核。

1. 准备水动力尾静脉注射用溶液

注意：使用感受态细菌通过克隆技术制备用于组成型和诱导型基因表达的质粒构建体。 

1. 准备无菌的0.9%注射用生理盐水（请 不要 使用PBS）。使用相当于小鼠体重约10%体积的生理盐水。示例：对于体重为20 g的小鼠，准备2 mL溶液。
2. 准备使用无内毒素质粒纯化试剂盒纯化的注射载体。
3. 每毫升无菌生理盐水中加入10 µg或15 µg无内毒素 sleeping beauty 载体构建物（分别使用10 µg，来自步骤4时使用15 µg）以及1 µg无内毒素pc-HSB5 。
4. 溶液可在4 °C保存最多4小时。请勿冷冻。

2. 进行水动力尾静脉注射

1. 使用尾静脉注射固定器（可使用市售产品或用带有通气孔和尾部穿出孔的50 mL锥形管自制）。在管底填充纸巾。
2. 用于注射的小鼠应为约8–10周龄，体重为20–25 g。
3. 注射前称量小鼠体重，并根据体重准备注射体积（相当于体重的10%）。准备一支无菌的3 mL注射器，配备27 G针头，吸入所需体积的液体。
4. 将小鼠放入固定器中。调整纸巾的用量，使小鼠活动空间最小化，但仍有足够空间呼吸。
5. 确保小鼠呼吸规律。
6. 使用红外灯加热尾部30–60秒。密切观察是否出现过热迹象。
7. 用酒精棉片清洁尾部。
8. 将针头几乎水平地插入尾部两侧静脉之一，靠近尾根部。
   注意： 若进针成功，可能有少量血液回流至针头前端。不建议主动回抽，因为针头的额外移动可能导致其移位和/或损伤静脉。
9. 在8–10秒内将全部液体注入尾静脉。
10. 立即从固定器中取出小鼠。按压注射部位至少30秒，或直至出血停止。
11. 将小鼠放入单独的笼子中。待小鼠从操作中恢复（约30–60分钟）后，将其转回原笼。在接下来的24小时内定期检查小鼠状况。
    注意： 注射后通常可观察到小鼠轻度镇静，持续时间可达2小时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% NaCl	Braun	3200905	静脉注射用载体
50 ml Falcon 圆底离心管	Corning Life Science	352095
红外灯	N/A	N/A	用于小鼠尾部加温
用于HTVI的Sleeping Beauty转座子载体克隆质粒
pTC	n/a		用于组成型基因表达的载体
pEN_TTmcs	Addgene	#25755	用于可诱导基因表达的入门载体
pEN_TTGmiRc2	Addgene	#25753	用于可诱导miRshRNA表达并共表达GFP的入门载体
pEN_TTmiRc2	Addgene	#25752	用于可诱导miRshRNA表达但不共表达GFP的入门载体
pTC ApoE-Tet	Addgene	#85578	使用ApoE.HCR.hAAT启动子实现可诱导基因或miR-shRNA表达的表达载体
pTC-CMV-Tet	Addgene	#85577	使用CMV启动子实现可诱导基因或miR-shRNA表达的表达载体