农杆菌介导的遗传转化：通过基因工程改造的根癌农杆菌对水稻基因组进行遗传转化的方法

摘要

来源：Xu, D., 等 农杆菌介导的遗传转化、转基因植株创制及其在水稻雄性生殖发育研究中的应用 视频实验杂志 (2020).

在本视频中，我们演示利用农杆菌介导法进行水稻基因组遗传转化的方法 Agrobacterium tumefaciens 双元载体。该细菌利用以下方法促进外源DNA质粒的转移 农杆菌 毒力蛋白。

方案

1. 水稻遗传转化与植物组织培养

1. 愈伤组织诱导与再生
   注意： 使用新鲜的幼嫩水稻花序作为起始材料诱导愈伤组织（图1).
   1. 从稻田或温室中采集处于减数分裂期的幼嫩花序，该时期可根据小花长度为1.6–4.8 mm来确定（图1A）。确保水稻花序被叶鞘覆盖。用70%酒精棉签擦拭每个花序，待其干燥后再进行切割。
   2. 将花序移至洁净的无菌操作台，用灭菌剪刀将其剪成小片段（越小越好），然后将片段转移至含有NBD2培养基的培养皿中图 1B, 表1).
   3. 在26 °C避光条件下培养约10–14天以诱导愈伤组织图2A).
      注意： 使用新形成的愈伤组织进行 农杆菌 侵染（步骤1.2.7）后可直接进行后续操作，或在新鲜的NBD2培养基中再次继代培养以获得更多愈伤组织。每隔8–10天将愈伤组织转移至新的NBD2培养基中。
2. 转化与共培养
   1. 使用 A. tumefaciens 含有用于转化的sgRNA-CAS9构建物的双元质粒的细菌。储存 A. tumefaciens YEB 培养基中的菌株（表1) 用50%甘油在-80 °C保存以备后续使用。
   2. 划线 A. tumefaciens 从-80 °C甘油菌种保存管转移至含有选择性抗生素的YEB琼脂培养基表1）并在25–28 ˚C下培养48–72 h，以使菌落显现。
   3. 从含有选择性抗生素的YEB平板上挑取单菌落，接种于5 mL含有相同选择性抗生素的液体YEB培养基中（表1)，置于50 mL锥形无菌试管中。在250 rpm条件下于摇床中振荡 x g，于 25–28 °C 培养至细菌生长至 OD₆₀₀ 0.5
   4. 向100 mL YEB培养基中加入1 mL细菌悬液（表1) 加入相同的选择性抗生素，在250 mL锥形瓶中，置于摇床以250 rpm振荡培养 x g，28 °C 下孵育 4 小时。
   5. 4,000 × g 离心 x g 室温下离心10分钟以收集细菌。弃去上清液。
   6. 用 AAM-AS 培养基重悬菌体沉淀（表1）并将菌液稀释至 OD₆₀₀ = 0.4.
      注意： 细菌悬浮液的最佳OD值对于高效的转化至关重要。它有助于消除愈伤组织上过多的细菌生长。
   7. 从步骤1.1.3中收集约150个生长良好、呈浅黄色且质地脆弱的胚性愈伤组织，放入一个150 mL无菌烧瓶中。将步骤1.2.6中制备的50–75 mL细菌细胞悬浮液加入该无菌烧瓶，随后添加10–25 mL新鲜AAM-AS培养基，浸没愈伤组织，浸泡10–20分钟，期间偶尔轻轻振荡。
   8. 小心倒出烧瓶中的细菌悬浮液，用无菌滤纸#1或纸巾吸干愈伤组织上多余的细菌悬浮液。然后将其转移至含有NBD-AS培养基的培养皿中表1用无菌滤纸#1覆盖，在25–28 °C避光培养3天，并检查是否有细菌过度生长。
3. 抗性愈伤组织筛选
   1. 共培养3天后，将愈伤组织转移至含有无菌滤纸的无菌培养皿中。
   2. 在洁净工作台上将愈伤组织风干2小时。确保愈伤组织未粘附于滤纸上。
   3. 用无菌镊子将愈伤组织均匀转移至初筛培养基 NBD2（含 40 mg/L 潮霉素和 250 mg/L 替门汀）表1在25–28 °C避光条件下培养愈伤组织2周。
   4. 2周后，将愈伤组织均匀转移至含有新鲜筛选培养基NBD2（含40 mg/L潮霉素和250 mg/L替门汀）的新培养皿中表1将愈伤组织在25–28 °C黑暗条件下继续培养2周。
4. 愈伤组织分化
   1. 将愈伤组织转移至新鲜的MS培养基（含25 mg/L潮霉素和150 mg/L特美汀）表1在25–28 °C条件下光照培养约2周。
   2. 再重复步骤 1.4.1 一次。
   3. 将茎芽转移到新的MS培养基（含10 mg/L潮霉素）上，以增殖更多茎芽。

表1：水稻转化培养基配方。 请点击此处下载该表格。

结果

图1： 诱导愈伤组织的起始材料。（A）减数分裂阶段的幼嫩水稻花序。（B）在NBD2培养基上生长的解剖后幼嫩花序。标尺 = 2 cm（A图）。