农杆菌介导的遗传转化：通过基因工程改造的根癌农杆菌对水稻基因组进行遗传转化的方法

摘要

来源：Xu, D., 等 农杆菌介导的遗传转化、转基因植株创制及其在水稻雄性生殖发育研究中的应用 视频实验杂志 (2020).

在本视频中，我们演示利用农杆菌介导法进行水稻基因组遗传转化的方法 Agrobacterium tumefaciens 双元载体。该细菌利用以下方法促进外源DNA质粒的转移 农杆菌 毒力蛋白。

方案

1. 水稻遗传转化与植物组织培养

1. 愈伤组织诱导与再生
   注意： 使用新鲜的幼嫩水稻花序作为起始材料诱导愈伤组织（图1).
   1. 从稻田或温室中采集处于减数分裂期的幼嫩花序，该时期可根据小花长度为1.6–4.8 mm来确定（图1A）。确保水稻花序被叶鞘覆盖。用70%酒精棉签擦拭每个花序，待其干燥后再进行切割。
   2. 将花序移至洁净的无菌操作台，用灭菌剪刀将其剪成小片段（越小越好），然后将片段转移至含有NBD2培养基的培养皿中图 1B, 表1).
   3. 在26 °C避光条件下培养约10–14天以诱导愈伤组织图2A).
      注意： 使用新形成的愈伤组织进行 农杆菌 侵染（步骤1.2.7）后可直接进行后续操作，或在新鲜的NBD2培养基中再次继代培养以获得更多愈伤组织。每隔8–10天将愈伤组织转移至新的NBD2培养基中。
2. 转化与共培养
   1. 使用 A. tumefaciens 含有用于转化的sgRNA-CAS9构建物的双元质粒的细菌。储存 A. tumefaciens YEB 培养基中的菌株（....

结果

图1： 诱导愈伤组织的起始材料。（A）减数分裂阶段的幼嫩水稻花序。（B）在NBD2培养基上生长的解剖后幼嫩花序。标尺 = 2 cm（A图）。